آنزیم‌ های مورد استفاده در سنتز زیستی زعفران

کشور ایران با توجه به شرایط آب و هوایی، بیش از ۹۵ درصد زعفران دنیا را تولید می‌کند و افراد متخصص بسیاری در این حوزه در حال تحقیق و پژوهش می‌باشند. دکتر نورالدین حسین پور آزاد اخیراً در خصوص آنزیم‌های مورد استفاده در سنتز زیستی زعفران، مطالعاتی انجام داده‌اند. به همین دلیل مصاحبه‌ای با ایشان در این خصوص انجام دادیم.

۱- با عرض سلام و خسته نباشید خدمت شما استاد گرامی، لطفاً خودتان را معرفی کنید و شرح مختصری از زمینه کاری، مرتبه علمی و سایر مسئولیت‌های خود بفرمایید.

اینجانب نورالدین حسین پور آزاد، دارای مدرک دکترای اصلاح نباتات با گرایش مهندسی ژنتیک بوده و در حال حاضر به عنوان استادیار دانشگاه محقق اردبیلی مشغول به فعالیت می­‌باشم. در کنار فعالیت آموزشی، عمده فعالیت‌های پژوهشی بنده در دو بخش مهندسی مسیرهای بیوسنتزی متابولیت­‌های ثانویه در گیاهان دارویی و شناسایی گونه­‌های گیاهی با روش DNA بارکدینگ می­‌باشد.

۲- اخیراً مقاله علمی در خصوص آنزیم‌های سنتز زیستی زعفران تحت عنوان “Candidate Enzymes for Saffron Crocin Biosynthesis Are Localized in Multiple Cellular Compartments” توسط شما و همکارانتان منتشر گردیده است، ضمن معرفی سایر همکارانتان، لطفاً توضیحاتی در خصوص ضرورت و هدف از انجام این کار بیان کنید.

☑ لینک مقاله

لازم است در رابطه با پیشینه انتشار این مقاله توضیحاتی ارائه نمایم که شاید تجربه‌ای باشد برای دانشجویان و محققانی که در ابتدای شروع یک کار تحقیقاتی هستند. زمانی که دانشجوی دکتری بودم، انتخاب پروپوزال با توجه به امکانات کمی که در اختیار داشتیم یکی از مشغولیت‌های فکری من در آن موقع بود. از یک طرف باید موضوعی انتخاب می‌کردیم که نتایج آن برطرف‌کننده یکی از مشکلات بخش کشاورزی می‌شد، از طرف دیگر موضوع انتخابی باید متناسب با امکاناتی می‌بود که در اختیار داشتیم؛ در غیر این صورت گروه آموزشی اجازه تعریف پروپوزال‌های فراتر از امکانات موجود را نمی‌داد. با توجه به ‌علاقه‌ای که در زمینه مهندسی متابولیت‌های زیستی داشتم، مقالات مختلفی در این زمینه مطالعه نمودم و یکی از مقالاتی که بیشتر توجه مرا به خودش جلب کرد حاصل یک گروه تحقیقاتی بیوتکنولوژی در یکی از مراکز ملی تحقیقاتی کشور ایتالیا موسوم به ENEA بود. این گروه پروژه­‌هایی در زمینه مهندسی مسیرهای بیوسنتزی کاروتنوئیدها را انجام می‌­داد. کاروتنوئید یکی از مهم‌ترین مسیرهای تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان بوده که این مسیر بیوسنتزی منجر به ساخت رنگ‌ریزه‌های زیستی هم‌چون رنگ زرد در کلاله زعفران می­‌گردد. با مکاتبه‌­ای که با سرپرست پروژه داشتم، خواسته خودم را مطرح نمودم و به ایشان گفتم که از جمله دغدغه‌های من انتخاب موضوعی است که بخشی از چالش­‌های بخش کشاورزی کشورم می‌­باشد. بعد از مدتی طی تماسی که با همدیگر داشتیم ایشان فرمودند که یکی از پروژه­‌های ما در رابطه با زعفران بوده که از جمله پروژه‌های تعریف شده در حوزه اتحادیه اروپا با نام Eurocaroten می‌باشد. پروپوزالی ارسال نمودند که آن را مطالعه کنم و بسط دهم و مجدداً برایشان ارسال نمایم. خوشبختانه نهایتاً این مکاتبات منجر به تعریف پروپوزالی تحت عنوان “بازسازی مسیر بیوسنتزی آپوکاروتنوئید زعفران در باکتری اشرشیاکلی” شد که با ارسال دعوتنامه‌ای از طرف گروه مربوطه جهت انجام این پروژه به مرکز تحقیقاتی ENEA اعزام شدم. همکاران ما در این پروژه از دانشگاه‌ها و مراکز تحقیقاتی کشورهای مختلفی هم‌چون ایتالیا، عربستان و انگلیس بودند.

۳- لطفاً در خصوص پیشینه فعالیت صورت گرفته در داخل و خارج از کشور توضیحاتی بفرمایید.

کشورمان بیش از ۹۵ درصد زعفران دنیا را تولید می­‌نماید و افراد متخصص بسیاری در این حوزه داریم که یافته‌های علمی آنان به عنوان منابع معتبر و پر استناد در سطح بین‌المللی می­‌باشد، و با وجود داشتن دانش‌ فنی؛ ابزارهای فنی لازم را هنوز در این حوزه در اختیار نداریم و اصولاً با بودجه و امکانات محدودی که مراکز دانشگاهی و تحقیقاتی در اختیار دارند تعریف چنین پروژه­‌هایی ریسک زیادی می­‌طلبد. به‌ خصوص اینکه هیچ صنعت خصوصی حاضر به سرمایه­‌گذاری در چنین پروژه­‌هایی با هزینه و ریسک بالا نمی‌­باشد. در این پروژه­‌ها به ظاهر اهداف تعریف شده به راحتی قابل احقاق هستند اما رسیدن به این اهداف با چالش‌­های متعددی همراه بوده که در صورت عدم کسب نتایج مثبت، هزینه و وقت بسیاری از دست خواهد رفت. به‌ خاطر این مسائل، اغلب محققان بخش زیستی فشارهای سنگینی جهت به انجام رساندن پروژه­‌هایشان متحمل می­‌شوند و صنایع رغبت چندانی به سرمایه­‌گذاری در این بخش‌ها را ندارند.

۴- لطفاً در خصوص تئوری فعالیت صورت گرفته و هم‌چنین اهمیت شناسایی آنزیم‌های زعفران، به صورت مختصر توضیح دهید.

رنگ زعفران (کروسین) حاصل یک سری از مسیرهای شکست آنزیمی از پیش ماده‌­ای به نام زآگزانتین می­‌باشد. در این تحقیق به شناخت مراحل پایین‌دست شکست آنزیمی حد واسط بین شکست زآگزانتین تا سنتز کروسین­‌ها پرداخته شد. تمام این فعل و انفعالات در کلاله زعفران اتفاق می‌افتند. در این مسیر بیوسنتزی، یک‌ سری ژن‌ها به صورت پشت سر هم بیان شده و آنزیم‌های حاصله در هر مرحله وظیفه خاصی را عهده­‌دار هستند و در هر مرحله عمل آنزیمی متابولیت خاصی ایجاد می‌­گردد که به‌ عنوان پیش‌ماده برای مراحل آنزیمی بعدی خواهند بود؛ که نهایتاً منجر به ایجاد رنگ زعفران می­‌گردد. جهت شناخت این مسیر ژنی باید هر یک از ژن‌ها از مبداء اصلی یعنی ژنوم زعفران ایزوله شده و وارد باکتری می­‌شدند.

۵- ضمن بیان نوآوری این تحقیق، روش انجام آزمایشات درون‌تنی، برون‌تنی، آنالیزهای مربوطه و نتایج این تحقیق را به صورت مختصر بیان کنید.

نظر به این‌که در مقاله انتشار یافته به‌ طور کامل به جزئیات انجام پروژه اشاره شده، نیازی به تکرار جزئیات نمی­‌بینم. در این پروژه که برای اولین بار در دنیا انجام پذیرفت، جهت مطالعه بیان آبشاری ژن‌های مسیر حد واسط شکست آنزیمی کاروتنوئید زآگزانتین تا بیوسنتز آپوکارتنوئید (مشتقات کاروتنوئیدی) کروسین در باکتری مهندسی‌شده اشرشیاکلی سویه BL21-pGro7 که قادر به بیان پروتئین­‌های چاپرونی با زیر واحدهای EL و ES بود، ابتدا باکتری با پلاسمیدهای نوترکیب بیانی pZea (سنتز کننده زآگزانتین) و pThio-CCD2 که در نتیجه بیان آنزیم شکننده کاروتنوئید دی اکسیژناز منجر به سنتز متابولیت هیدروکسی بتا آپو-‘۸-کاروتنال از طریق شکست کاروتنوئید زآگزانتین می­‌شد، تراریخت گردید. تأیید وجود متابولیت هیدروکسی بتا آپو-‘۸-کاروتنال در عصاره باکتری با دستگاه کروماتوگرافی مایع مجهز به طیف‌سنج جرمی (Lc-Mass-Mass) صورت گرفت. در ادامه توالی ژنی کد کننده آنزیم­‌های آلدئید دهیدروژناز (ALDH7) و گلیکوزیل ترانسفراز (UGT)، در پلاسیمید بیانی pThio-Dan تحت پروموتور القایی آرابینوز و دنباله توالی آمینو اسیدی هیستیدینی انتهای C، با استفاده از روش Gibson Assembly ساب‌کلون گردیده و با روش الکتروپوراسیون در باکتری انتقال داده شدند. ارزیابی بیان ژن‌های ALDH7 و UGT، با القاء محیط کشت باکتریایی BL21-pGro7 تراریخت شده با پلاسمیدهای pZea و پلاسمید حاوی توالی اپرونی pThio-CCD2-ALDH7 و پلاسمید pThio-UGT، با غلظت‌های متفاوت از آرابینوز صورت گرفته و به دنبال آن، آنالیز متابولیت­‌های قطبی و غیر­قطبی استخراج شده از رسوب باکتری با دستگاه کروماتوگرافی مایع انجام پذیرفت. هم‌چنین ارزیابی آنزیمی پروتئین­‌های بیان شده از طریق الکتروفورز SDS-PAGE و روش وسترن بلات با به‌کارگیری آنتی‌بادی ضد هیستیدین صورت پذیرفت. علاوه بر این، جهت شناخت بهتر عملکرد آنزیمی UGT، ارزیابی زیستی این آنزیم در حضور واحدهای UDP- گلوکز و کروستین انجام گردید. نتایج حاصل از بیان آبشاری ژن‌های مسیر بیوسنتزی کروسین در باکتری اشریشیاکلی، منجر به شناسایی دو نوع از ایزومرهای کروسین-۱ و کروسین-‘ ۲ گردید. البته آزمایش‌های تکمیلی دیگری هم در جهت تأیید مکان‌های هدف متابولیت‌های سنتز شده انجام پذیرفت که توضیح آن از حوصله بحث خارج می‌باشد.

۶- با توجه به اینکه زعفران جزو محصولات ارزشمند کشورمان محسوب می‌شود، به نظر شما تحقیق صورت گرفته چگونه و تا چه حد می‌تواند در کشت زعفران داخلی اثرگذار باشد؟

شناخت دقیق مسیرهای بیوسنتزی متابولیت‌­های گیاهی هم‌چون کروسین­‌ها می‌تواند به عنوان نقشه راهی دقیق در تعیین استراتژی­‌های به‌زراعی و به‌نژادی در بهبود صفات کیفی و کمی مانند رنگ و عطر در گیاه زعفران باشد و هم‌چنین امکان بیان هترولوگ و تولید هریک از این متابولیت­‌های با ارزش را به طور مجزا و در میکروارگانیزم‌­های پروکاریوتی و یوکاریوتی فراهم می­‌نماید.

۷- به نظر شما تحقیق صورت گرفته تا چه حد مورد توجه بخش کشت، صنایع مرتبط و نهادهای دولتی و سیاست‌گذار قرار خواهد گرفت؟

واقعیت این است که از یک طرف مردم را تشویق به استفاده از گیاهان دارویی یا داروهای گیاهی می‌نماییم و از طرفی حرف از حفاظت ذخایر ژنتیکی گیاهی و جلوگیری از فرسایش منابع طبیعی سخن می­‌گوییم. مطلع هستید که تولید‌کننده مواد مؤثر داروهای گیاهی، گیاهان طبیعی هستند. برداشت چنین منابعی بدون جایگزینی منجر به عاری شدن مراتع از پوشش گیاهی و فرسایش طبیعی خواهد شد. راه برون‌رفت از چنین چالش‌های مخرب، توسعه سیستم‌های مدرن گلخانه‌ای تولید گیاهان دارویی و روش‌های تولید متابولیت‌­های گیاهی در سطوح سلولی و در بیو راکتورهای زیستی است. پروژه‌­ای که انجام شد در واقع استراتژی اصلی آن همین موضوع بود. جهت تولید طبیعی ماده کروسین در کلاله­‌های زعفران، ما نیازمند یک سال زراعی با هزینه­‌های مربوط به خود هستیم و در عین حال ماده تولید شده نیازمند فرآوری و خالص­‌سازی آن از مجموعه مواد متابولیتی تولید شده در گیاه است. در صورتی که با بیان نوترکیب ژن‌های دخیل در سنتز این ماده در میکروارگانیسم­‌هایی هم‌چون باکتری‌ها در مدت یک شبانه روز قادر به تولید این ماده خواهیم بود. امیدوارم نهادهای دولتی سیاست‌گذار، زمینه­‌های اشتغال از چنین علوم نوینی را فراهم نمایند.

۸- موانع و مشکلاتی که در این پروژه با آن مواجه بودید را بیان کنید.

یقیناً بیان هم‌زمان چندین ژن که عملکردشان زنجیره‌­ای به همدیگر وابسته بوده تا مواد به خصوصی را سنتز نمایند به مراتب مشکل‌تر از بیان تک ژنی می‌باشد. با مشکلات متعددی در تراریختگی سویه­‌های باکتریایی مواجه بودیم. یکی از این مشکلات عدم ایجاد کلنی در تراریختگی سویه­‌های باکتریایی با بیش از سه پلاسمید نوترکیب بود. احتمالات متعددی برای این مشکل متصور بود، از جمله اینکه تعدد ژن­‌های انتقالی و بیان هترولوگ در یک سویه باکتریایی که هر یک دارای مقاومت به آنتی­‌بیوتیک مختلفی بودند، احتمالاً منجر به بالا رفتن فشار متابولیکی شده است و جهت اینکه باکتری بتواند در محیط حاوی آنتی‌بیوتیک­‌های متعدد قابلیت حیات داشته باشد، به طور هوشمندانه­‌ای برخی از مسیرهای دیگر متابولیکی خود را به حالت خاموش نگه می‌دارد که ادامه این وضعیت منجر به از بین رفتن باکتری و در نتیجه عدم ایجاد کلنی می‌گردد. جهت رفع این مشکل در فرایند انتقال با الکتروپوراسیون و کاهش احتمالی بار متابولیکی ایجاد شده از بابت بیان ژن‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک، ژن‌های CCD2 و ALDH7 به صورت سیس در پلاسمید بیانی (pThio-ALDH7-CCD2) که تنها دارای مقاومت به آنتی­‌بیوتیک آمپی­سیلین به جای آنتی­‌بیوتیک­‌های کلرآمفنیکل و آمپی­سیلین در حالت ترانس (پلاسمیدهای جداگانه pThio-CCD2 و pThio-ALDH7) بود، قرار گرفتند. با انتقال پلاسمیدهای pZea ،pThio-CCD2-ALDH7 کلنی نوترکیب ایجاد گردیده و متابولیت مورد انتظار کروستین در عصاره ترانسفورمانت­‌های مرتبط شناسایی گردید. نمونه‌­های دیگری از موانع هم بودند که مرحله به مرحله مرتفع می­‌گردیدند. در واقع همین موانع و یافتن راهکارهاست که لذت آزمایش‌های زیستی را دو چندان می­‌نماید.

۹- لطفاً نام سازمان و یا نهادهایی که پروژه شما را حمایت کرده‌اند بیان کنید.

با توجه به اینکه بنده بورسیه دانشگاه محقق اردبیلی بودم، کمک هزینه اقامت در دوره فرصت مطالعاتی از طرف سازمان امور دانشجویان وزارت علوم، تحقیقات و فناوری ایران تقبل گردید. اما تأمین تمامی هزینه­‌های آزمایشگاهی این پروژه بر عهده سازمان‌های تعریف شده در حوزه اتحادیه اروپا از جمله Eurocaroten بود.

۱۰- ضمن تشکر و قدردانی از وقتی که به ما اختصاص دادید، به عنوان بخش پایانی اگر صحبتی برای خوانندگان دارید بفرمایید.

در پایان از احساس مسئولیتی که در جهت ارج نهادن به یافته­‌های محققین کشور می­‌کنید نهایت سپاس‌گزاری را دارم. سرمایه اصلی هر کشوری یقیناً جوانان آن مملکت هستند. در بیشتر زمینه‌­های علمی، ما دارای دانش فنی لازم هستیم اما از نظر ابزارهای فیزیکی در اکثر حوزه­‌های علمی با محدودیت‌های عمده مواجه هستیم که ان‌شالله امیدواریم مسئولین امر بتوانند بسترهای لازم را فراهم نمایند. حتی الامکان سعی نمودم به زبان ساده به سؤالات شما پاسخگو باشم، در غیر این‌صورت عذرخواهی مرا پذیرا باشید. مجدداً از زحمات شما سپاسگزارم.