اعتبارسنجی خط سلولی در فرآیند تولید زیست‌دارو
در پی انتشار گزارش‌هایی مبنی بر شناسایی اشتباه و آلودگی سلول‌ها در مطالعات مختلف، مسئله اعتبارسنجی خط سلولی طی چند سال گذشته به شکل جدی‌تری مورد بحث قرار گرفته است. شکست در اعتبارسنجی صحیح خط سلولی در حوزه تولید زیست‌دارو، می‌تواند با پیامدهای مالی قابل توجهی برای تولیدکنندگان همراه باشد.
مشکل موجود در این زمینه ممکن است تا جایی وسعت داشته باشد که حتی بیمار نیز در پی مصرف دارو دچار عوارض جانبی شود. تأیید هویت، خلوص، سترونی و عملکرد خط سلولی به تضمین ایمنی زیست‌دارو کمک می‌کند. مشکلات مربوط به خط سلولی نه تنها در پژوهش‌های عادی، بلکه در مطالعات پیش‌بالینی نیز مشکلزا بوده است. با توجه به این که نتایج چنین مطالعاتی در تعداد زیادی از مقالات مرتبط ذکر می‌گردد، غیرقابل اعتماد بودن این نتایج می‌تواند حاصل چندین سال کار و تلاش را زیر سؤال ببرد. در عرصه تولید زیست‌دارو، اعتبارسنجی تنها به معنی تأیید هویت خط سلولی نیست؛ بلکه باید خلوص، سترونی، و عملکرد خط سلولی را نیز مطابق با استانداردهای تعییشن شده مورد ارزیابی قرار دهد.
تأیید هویت خط سلولی
تأیید هویت خط سلولی فرایندی است که پیش از رسیدن سلول به آزمایشگاه آغاز می‌شود. مایکل هنتمن (Michael Hantman) -معاون اجرایی و مسئول توسعه روش و اعتبارسنجی در آزمایشگاه چارلز ریور (Charles River)- می‌گوید: “مستندسازی پیشینه خط سلولی به اندازه انجام آزمایش بر روی همان خط سلولی اهمیت دارد. عدم توانایی در تأیید هویت خط سلولی برای آژانس‌های نظارتی، حکم یک چراغ قرمز بزرگ را خواهد داشت.”
هرگاه تولیدکننده شواهد کافی را در مورد پیشینه و ویژگی‌های خط سلولی جمع‌آوری نماید، می‌تواند راه‌های متنوعی را برای تأیید اعتبار هویت سلول به کار گیرد. این راه‌ها از بررسی‌های ریخت‌شناسی گرفته تا تهیه کاریوتیپ و روش‌های توالی‌یابی ژن، متغیر است.
روش‌های مربوط به فنوتیپ، مانند ریخت‌شناسی سلول و آنالیز منحنی رشد، شاید ساده‌ترین روش‌های مورد استفاده جهت اعتبارسنجی خط سلولی باشند. مجموعه کشت تیپ آمریکا (ATCC)، ارزیابی سریع و مکرر ویژگی‌های ظاهری سلول را به عنوان روشی مناسب برای این کار پیشنهاد داده است. ارزیابی ریخت سلول، روش انعطاف‌پذیری است که می‌توان آن را بر اساس تراکم سلول در محیط کشت، وضعیت تمایز و سلامت سلول‌ها، و ترکیب محیط؛ تغییر داد. ریخت سلولی نامتعارف می‌تواند نشان‌دهنده مشکلات زمینه‌ای از جمله آلودگی به یک خط سلولی یا ریزجاندار دیگر باشد. به طور مشابه، بروز تغییرات ناگهانی در رشد نیز ممکن است حاکی از وجود یک مشکل دیگر باشد. این مهم است که ثبات رشد سلول به کمک منحنی‌های رشد تحت نظارت قرار گیرد.
آنالیز ایزوآنزیم یکی دیگر از روش‌های ارزان‌قیمت و نسبتاً سریع برای شناسایی گونه آلوده‌کننده و تأیید وجود آلودگی متقاطع در محیط کشت است. ایزوزیم (isozyme) یا ایزوآنزیم‌ها، شکل‌های نسبتاً متفاوتی از یک آنزیم هستند که واکنش یکسانی را پیش می‌برند. این شکل‌های آنزیمی اغلب در تعدادی از آمینواسیدهای خود با یکدیگر تفاوت دارند. شکل‌های متفاوتی برای تعدادی از آنزیم‌های درون سلولی وجود دارد. روش آنالیز ایزوآنزیم از الکتروفورز برای نشان دادن تفاوت‌های نامحسوس در ساختار و تحرک شکل‌های مختلف آنزیمی استفاده می‌کند. به کمک این روش می‌توان الگوهای توزیع منحصر به فردی را برای گونه‌های مختلف به دست آورد.
از دیدگاه هنتمن؛ تهیه‌ی کاریوتیپ، از روش‌های کلاسیک و بسیار آموزنده است. دانشمندان به کمک این روش می‌توانند از روی تعداد و ظاهر کروموزوم‌ها گونه آلوده‌کننده را تشخیص داده و از الگوهای نامعمول در چیدمان کروموزوم‌ها نیز برای شناسایی خط‌های سلولی انسانی بهره بگیرند. تعدادی از الگوهای نامعمول در چیدمان کروموزوم‌ها در مطالعات قبلی گزارش شده است.
پیشرفت‌های اخیر صورت گرفته در زمینه توالی‌یابی ژن، این تکنیک را مقرون به صرفه‌تر و کارآمدتر از گذشته ساخته است. از روش توالی‌یابی ژن می‌توان در تعیین مشخصات خط سلولی بهره گرفت. وسعت این توالی‌یابی ممکن است از یک ژن منفرد تا کل ژنوم، متغیر باشد.
بارکدینگ DNA، روش پرکاربردی است که به منظور تجزیه و تحیل منشأ گونه به کار گرفته می‌شود. در این روش، با اصطلاحی به نام “بارکد حیات” مواجه می‌شویم که عنصر بسیار مهمی به حساب می‌آید. بارکد حیات، منطقه‌ای به شدت حفظ شده در زیرواحد I ژن سیتوکروم اکسیداز میتوکندریایی است. این منطقه از DNA، از توالی کوتاهی تشکیل شده است. با این حال، همان‌طور که در مورد آنالیز ایزوآنزیم هم صحبت شد، بارکدینگ DNA نمی‌تواند خط سلولی را در سطح زیرگونه‌ای تمییز دهد.
در سمت دیگر، برخی از شرکت‌ها را داریم که به منظور توالی‌یابی کل ژنوم یا کل اگزوم یک خط سلولی خاص، به استفاده از توالی‌یابی نسل جدید (NGS) روی آورده‌اند. محبوبیت این روش نوین به دلیل کاهش هزینه کل توالی‌یابی، رو به افزایش است؛ چرا که حجم بالایی از داده‌ها را در زمان کم در مورد هر خط سلولی فراهم می‌کند.
جهت شناسایی خط سلولی در سطح زیرگونه، استفاده از توالی‌های خاصی به نام STR توصیه شده است. STR یا “تکرارهای پشت سر هم کوتاه” انواعی از توالی‌های غیرکدکننده در DNA هستند که بر اساس طول خود به چندین دسته تقسیم می‌شوند. آنالیز STR روشی اختصاصی است که با استفاده از همین توالی‌ها می‌تواند ارتباط بین افراد یا گونه‌ها را تعیین سازد. این تکنیک در اصل برای کمک به پیشبرد تحقیقات جنایی در آزمایشگاه‌های پزشکی‌قانونی طراحی شده بود. از جمله متداول‌ترین کاربردهای آنالیز STR، تعیین ابوت (paternity test) است. تعداد این واحدهای تکرار شونده اغلب میان افراد متفاوت است. جایگاه‌های مربوط به STR بر روی هر کروموزوم، اثر انگشت ژنتیکی هر فرد را تعیین می‌کند.
امروزه آنالیز STR به یک استاندارد طلایی برای اعتبارسنجی خط سلولی انسانی تبدیل شده است. شرکت‌هایی مانند Thermo Fisher Scientific کیت‌هایی به این منظور ارائه نموده‌اند که پژوهشگر می‌تواند به راحتی و بدون نیاز به کمک خاصی از آن‌ها بهره بگیرد. کیت‌های تقویتی، AuthentiFiler ،Identifiler Plus Identifiler Direct و GlobalFiler PCR از این شرکت، به ترتیب حاوی پرایمرهایی برای ۹، ۱۵، ۱۵ و ۲۱ جایگاه STR است که بر روی کروموزوم‌های اتوزوم قرار دارند. این توالی‌های کوتاه تکرار شونده عیناً مثل هم نیستند. پرایمر آملوژنین نیز به عنوان یک نشانگر جنسی در این کیت‌ها لحاظ شده است؛ چرا که ژن این پروتئین بر روی کروموزوم X قرار دارد. کیت‌های مذکور و سایر کیت‌های مشابه، از پرایمرهای نشان‌دار (فلورسنت) استفاده می‌کنند. این نوع از پرایمرها، امکان تقویت‌سازی چندین جایگاه STR را طی تنها یک واکنش PCR فراهم می‌سازند.
پس از تقویت‌سازی، پژوهشگر می‌تواند به کمک الکتروفورز مویین، جایگاه‌های STR را بر اساس رنگ و یا اندازه جداسازی کند. نتایج حاصل در نهایت با پروفایل‌های مرجع در پایگاه داده‌ها مقایسه می‌شوند تا هویت خط سلولی تأیید گردد. پژوهشگر هم‌چنین قادر خواهد بود با استفاده از نرم‌افزارهای GeneMapper ID-X و GeneMapper 5، خود به ساخت پروفایل‌های مرجع بپردازد. این دو نرم‌افزار نیز به شرکت ترمو فیشر تعلق دارند.
نرم‌افزار GeneMapper هم‌چنین به پژوهشگر این امکان را می‌دهد که بر تغییرات طولی در پروفایل‌های STR نظارت داشته باشد. این تغییرات در کنار طیف گسترده‌ای از نشانگرهای STR، به تعیین رانش ژن کمک می‌کند. DNS با هر تقسیم سلولی می‌تواند جهش‌هایی را کسب نماید. این جهش‌ها ممکن است در ادامه به بروز ناهمگونی‌هایی میان جایگاه‌های STR منجر شده و تفسیر نتایج را دشوارتر سازند.
مانع اساسی‌تر در مقابل کاربرد گسترده آنالیز STR، فقدان کنونی کیت‌ها، دستورالعمل‌ها و پایگاه داده‌ها برای سلول‌های غیر انسانی است. با وجود آن که خط‌های سلولی انسان در میان تولیدکنندگان محبوبیت پیدا کرده است، اما استفاده از تخم‌دان همستر چینی و خط سلولی موش برای تولید پروتئین، هم‌چنان متداول است. به نظر می‌رسد FBI انگیزه چندانی برای دستگیر کردن این همسترهای چینی نداشته است(!)؛ که برای صنعت داروسازی جای تأسف دارد.
اخیراً مؤسسه ملی استاندارد و تکنولوژی (NIST) با ATCC وارد همکاری شده است تا کنسرسیومی را به منظور ترویج استفاده از آنالیز STR برای اعتبارسنجی خط سلولی موش تشکیل دهد. این کنسرسیوم که هم‌اکنون “کنسرسیوم اعتبارسنجی خط سلولی موش (MCLAC)” نام دارد، از ۱۳ آزمایشگاه مختلف تشکیل شده است. اعضای MCLAC تاکنون ۵۰ مورد از پرکاربردترین خط‌های سلولی موش را به کمک آزمایش PCR چندگانه مورد بررسی قرار داده‌اند. مطابق با صحبت‌های جیمی آلمایدا (Jamie Almeida) -از گروه روش‌های زیست‌سنجی در NIST- نتایج این مطالعه اواخر سال جاری منتشر خواهد شد. او توضیح می‌دهد: “پروفایل‌های تأیید شده برای خط‌های سلولی موش، با بهره‌گیری از داده‌های کنسرسیوم، مشخص خواهند شد. این پروفایل‌ها از طریق پایگاه داده NCBI در دسترس علاقمندان قرار خواهد گرفت.”
تعیین آلودگی خط سلولی
در فرایند اعتبارسنجی خط سلولی؛ هویت، خلوص و سترون بودن نیز باید مورد تأیید قرار بگیرد. آلودگی متقاطع می‌تواند بازده تولید، کیفیت و ایمنی زیست‌دارو را تحت‌الشعاع قرار دهد. جلوگیری از بروز آلودگی متقاطع، اصلی‌ترین دلیلی است که تولیدکنندگان را ملزم به اعتبارسنجی سلول‌هایی می‌کند که در ساخت زیست‌دارو مورد استفاده قرار گرفته‌اند. تولیدکنندگان مطابق با گونه خط سلولی خود، پانل‌هایی را برای شناسایی آلودگی ویروسی –از نوع اکتسابی– انتخاب می‌کنند. تعیین آلودگی به HIV یا ویروس نقص ایمنی انسان، یکی از همین آزمون‌هایی است که بر روی خط‌های سلولی انسان انجام می‌شود. تعیین آلودگی به سایر ویروس‌ها نیز به همین ترتیب انجام می‌شود. باید توجه داشت که آزمون تعیین آلودگی به ویروس خاص یک گونه، بر روی خط سلولی از گونه دیگر انجام نمی‌شود.
هنری چیو (Henry Chiou) -معاون اجرایی در آزمایشگاه Life Science Solutions (زیرمجموعه ترمو فیشر)- می‌گوید: “در صورتی که نتوانید خط سلولی را به درستی شناسایی کنید، ممکن است در ادامه کار از آرمایشهای نامربوط بهره بگیرید.” این مسئله می‌تواند خطراتی برای بیمار ایجاد کند. البته، آن‌طور که چیو می‌گوید، این یک سناریوی بسیار افراطی است و قرار نیست برای هر کسی رخ بدهد.
ویروس‌های اکتسابی تنها آلوده‌کننده‌هایی نیستند که دانشمندان باید از وجود آن آگاه باشند. باکتری مایکوپلاسما نیز امروزه به وفور در آلودگی‌های خط سلولی به چشم می‌خورد. مشکل اصلی این است که مایکوپلاسما حتی در زیر میکروسکوپ‌های فازی یا زمینه روشن و با بزرگ‌نمایی بالا نیز قابل شناسایی نیست. این باکتری به راحتی می‌تواند مواد مغذی را بدون تغییر کدورت یا pH محیط کشت، از دسترس سلول خارج سازد. آلودگی به مایکوپلاسما نه تنها می‌تواند منجر به کاهش رشد سلول و تولید پروتئین شود، بلکه خطر بیماری‌زایی را نیز افزایش می‌دهد.
برای تعیین آلودگی به مایکوپلاسما چندین روش وجود دارد؛ از جمله کشت مستقیم، کشت غیرمستقیم و آزمایش‌های PCR. روش کشت مستقیم، به عنوان استاندارد طلایی برای شناسایی مایکوپلاسما، به خوبی می‌تواند شرایط لازم برای کشت مایکوپلاسما در محیط آگار را فراهم نماید. ظاهر نیمرویی‌شکل کلنی‌‌ها در آگار و تغییر رنگ واضح، نشان‌دهنده آلودگی با این باکتری است.
کشت مستقیم مایکوپلاسما به دوره‌های طولانی‌مدت نهفتگی (انکوباسیون) نیاز دارد و حداقل ۲۸ روز طول می‌کشد تا تکمیل شود. به علاوه، علی‌رغم حساسیت بالای کشت مستقیم، این روش نمی‌تواند سویه‌های سخت‌رشد مایکوپلاسما را در محیط شناسایی کند. به همین سبب، دانشمندان برای شناسایی سویه‌های غیرقابل کشت این باکتری، از آزمایش تست غیرمستقیم، استفاده می‌کنند. کشت غیرمستقیم باکتری به کمک نوعی رنگ فلورسنت صورت می‌گیرد که به DNA مایکوپلاسما متصل می‌شود. تشخیص آلودگی از طریق آشکارسازی تابش فلورسانس برون‌هسته‌ای امکان‌پذیر خواهد بود، چرا که مایکوپلاسماها (و بیشتر باکتری‌های دیگر) فاقد هسته‌اند.
آزمایش‌های مبتنی بر PCR از جمله روش‌های قابل اعتماد جهت شناسایی مایکوپلاسماهای قابل کشت و غیرقابل کشت به شمار می‌آیند. سازمان‌هایی مانند ATCC، سرویس‌ها و کیت‌های مبتنی بر PCR را جهت شناسایی مایکوپلاسما به آزمایشگاه‌ها ارائه می‌کنند. کیت جهانی ATCC می‌تواند بیش از ۶۰ گونه از این باکتری بسیار کوچک را شناسایی کند.
آزمون‌های مربوط به ارزیابی عملکرد خط سلولی
با این که هویت، خلوص و سترون بودن خط سلولی باید در حین تولید زیست‌دارو تأیید گردد؛ اما اصلی‌ترین کانون توجه، خود محصولی است که به بازار مصرف ارائه می‌شود. حتی توالی‌یابی کل ژنوم هم نمی‌تواند تضمین کند که خط سلولی مورد استفاده، حجم بالایی از پروتئین‌های عملکردی باکیفیت را تولید خواهد نمود. بنابراین، قدم نهایی در اعتبارسنجی، ارزیابی توانایی خط سلولی در تولید مداوم پروتئین با کیفیت بالا است. لئون سونگ (Leon Song)، مدیر اجرایی شرکت GenScript، توضیح می‌دهد: “پس از این که پروتئین ساخته شد، سطح mRNA باید به کمک qPCR تعیین شود. خود پروتئین نیز باید از طریق یک آنتی‌بادی ویژه و با استفاده از تکنیک وسترن بلات مورد بررسی قرار بگیرد، تا از کیفیت محصول اطمینان حاصل گردد.” قدم بعدی، بررسی فعالیت پروتئین با استفاده از آزمایش‌هایی است که برای بررسی عملکرد پروتئین طراحی شده‌اند.
تولیدکنندگان زیست‌دارو، در مقایسه با پژوهشگران پیش‌بالینی، بازی کاملاً متفاوتی را پیش رو گرفته‌اند که قوانین و داوران متفاوتی هم دارد. اعتبارسنجی هویت، خلوص، سترونی و عملکرد خط سلولی با استفاده از روش‌هایی که سازگار با قانون، موفقیت محصول و امنیت بیمار را تضمین می‌کند. هنتمن در پایان اضافه می‌کند: “هیچ آزمونی به تنهایی همه پاسخ‌هایی را که تولیدکننده نیاز دارد فراهم نمی‌کند. رویکردهای چند منظوره برای انجام اعتبارسنجی، قابل اعتمادتر بوده و عملکرد بهتری را نیز نشان داده‌اند.”
☑ ترجمه و بارنویسی: آزاده داودی
☑ لینک خبر
