توالی یابیدیدگاه

توالی‌یابی نسل بعدی داروهای ضدسرطان در رویکرد پزشکی دقیق

با وجود تلاش‌ها و پژوهش‌های بسیار زیادی که در زمینه پیشگیری و درمان انواع مختلف سرطان‌ها انجام شده است، همواره دانشمندان در درمان موفقیت‌آمیز و نظام‌مند این نوع بیماری‌ با چالش‌ها و غافلگیری‌های متعددی روبه‌رو بوده‌­اند. در حال حاضر روش‌های درمانی موفقیت‌آمیز زیادی برای مقابله با سرطان ارائه شده است. با این وجود، بسیاری از بیماران به‌طور کامل به این نوع درمان‌ها پاسخ نمی‌دهند و یا در مراحل بعدی با یک بیماری متاستاتیک مقاوم به دارو درگیر خواهند شد. این عدم پاسخگویی، به نوع سرطان و مراحل پیشرفت بیماری وابسته است. علی‌رغم توسعه روش‌های درمانی هدفمند و جدید، تاکنون اثربخشی بسیاری از این روش‌ها مورد ارزیابی قرار نگرفته‌‌ است. در تلاش برای بهبود این حوزه از داروهای هدفمند، پروفسور Lauri Paasonen و همکارانش از پتانسیل سلول‌های مشتق‌شده از بیماران سرطانی (PDC) برای ارائه یک استراتژی درمانی شخصی‌ استفاده کرده‌اند. این راهبرد هدفمند و مؤثر بر درمان تومورهای جامد متمرکز شده است.


در رویکرد پزشکی دقیق، به ‌منظور یافتن اهداف دارویی بالقوه و استفاده بالینی از نتایج حاصل از آن، داده‌های بالینی و امیکس از بیماران جمع‌آوری می‌شود. آنچه در این مطالعه اهمیت زیادی دارد توجه به این نکته است که یافته‌های مذکور می‌توانند در درک مقاومت دارویی ناشی از ناهمگونی‌های بین توموری و درون توموری مؤثر واقع شوند. به‌عبارت دیگر، این ناهمگونی‌ها هم در بین تومورهای مختلف و هم در یک نوع تومور قابل تشخیص هستند.

از سوی دیگر، علی‌رغم بررسی کامل تغییرات ژنومی، تنها تعداد معدودی از این تغییرات و جهش‌ها‌ با داروهای هدفمند موجود در بازار قابل درمان هستند. این مشکل منجر به توسعه رویکرد کاربردی پزشکی دقیق شده است که در درمان انواعی از سرطان‌های شایع نظیر لوسمی موفق عمل کرده است. یکی از بزرگترین امتیازات بهره‌گیری از این رویکرد کاربردی، امکان استفاده مستقیم (بدون نیاز به مراحل کشت سلولی) از PDCها در آزمایشات مقاومت و حساسیت دارویی است که در خارج از بدن فرد بیمار انجام می‌شوند.

تاکنون پاسخ PDCها بسته به بستر آزمایش، علیه صدها داروی تأییدشده و تحقیقاتی مختلف مورد بررسی قرار گرفته است. ترکیبی از داده‌های حاصل از پاسخ‌های دارویی، داده‌های ارائه شده از امیکس‌های فنوتیپی و ژنوتیپی به همراه اطلاعات بالینی بیمار امکان بهره‌گیری از یک استراتژی درمانی شخصی‌ و کابردی را فراهم ساخته است. استفاده از رویکرد پزشکی دقیق در درمان تومورهای جامد در مقایسه با لوسمی و سایر سرطان‌های هماتولوژیک دیگر با پیچیدگی‌های بسیار زیادی همراه است. علت اصلی این پیچیدگی‌ها، مشکلات و چالش‌های رشدی PDCهای اولیه در محیطی است که امکان پایداری و حفظ خصوصیات مولکولی آن‌ها را فراهم می‌کند.

توسعه بهتر و بیشتر شرایط کشت PDCهای بالغ دو بعدی و سه بعدی (تحت عنوان اسفروئید/ارگانوئید) باعث بهبود مدل‌های PDC شده است. این مدل‌های توسعه‌یافته از نظر عملکردی، ژنوتیپی و فنوتیپی با بافت سرطانی اولیه مطابقت دارند. امروزه کشت‌های تک لایه و دو بعدی سلول‌های توموری اپیتلیال به‌طور مؤثر در آزمایشات دارویی پر توان مورد استفاده قرار می‌گیرند. با این‌حال به‌طور معمول PDCهایی که به‌صورت ارگانوئیدهای سه بعدی رشد می‌کنند، مدل‌های فیزیولوژیکی با اهمیت‌تر و ساختارهای ژنومی و فنوتیپی پایدارتری به‌شمار می‌روند.

بهینه‌سازی روش‌های درمانی در مطالعات انجام شده با ارگانوئیدهای سرطانی از اهمیت زیادی برخوردار است. به‌عنوان مثال، رشد آهسته این سلول‌ها، کاربرد آن‌ها را در آزمایشات دارویی پرتوان محدود ساخته است. مسئله مهم‌تر این است که همه انواع PDCهای کشت‌شده در آزمایشگاه، باید توالی‌یابی ژنتیکی شوند. این‌کار به‌منظور تأیید حضور جهش‌های درایور سرطانی مشابه با بافت توموری اولیه در سلول‌های مذکور انجام می‌شود. آزمایشات دارویی انجام شده با سلول‌های تعیین ویژگی‌شده (به‌صورت ژنتیکی و فنوتیپی) مشتق‌شده از تومورهای جامد امکان درمان‌ ویژه هر بیمار را فراهم می‌سازد. به‌عبارت دیگر، استفاده از این سلول‌ها در یافتن فرصت‌های هدفمند دارویی و ارائه مدل‌های سلولی مناسب در کشف دارو مؤثر خواهد بود.

تا به امروز روش‌های تعیین توالی‌یابی نسل جدید (NGS) تأثیر زیادی در تحقیقات ژنومی داشته‌ است. فناوری‌های توالی‌یابی پرتوان به‌منظور تعیین توالی مقادیر ژنی زیاد ارائه شده‌اند. از جمله این فناوری‌ها می‌توان به روش تعیین توالی کامل اگزوم (با 23000 ژن مختلف) اشاره کرد. این فناوری‌ها در تجزیه و تحلیل کمّی فراوانی جهش‌ها مؤثر هستند. توسعه فناوری‌های تعیین توالی پرتوان، استفاده از توالی‌یابی‌ ژنومی را به یک ابزار بالینی کاربردی تبدیل کرده است. تعیین ویژگی‌های جهش‌های سوماتیک و تغییرات تعداد کپی در PDCها امکان تطابق دقیق این سلول‌ها با بافت‌های توموری مشتق‌شده از آن‌ها را‌ فراهم ساخته است. از سوی دیگر، استفاده از سلول‌های تعیین ویژگی شده به‌عنوان یک گام مهم در ارائه سایر روش‌های مبتنی بر PDC مطرح می‌شود.

توالی‌یابی کامل اگزوم (WES) یا توالی‌یابی پانل سرطان هدفمند بر روی PDCهای مشتق‌شده از بافت‌برداری‌‌های مایع و نمونه‌های تومور جامد قابل اجرا است، اما در اغلب موارد، برای سنجش مقدار محدودی از PDCها شرایط خاصی نیاز است. علاوه بر این، جداسازی DNA با کیفیت و مقدار کافی PDCهای تومور جامد کشت‌شده در ماتریکس سه بعدی نیز با چالش‌هایی روبه‌رو است. از جمله این چالش‌ها می‌توان به حذف سخت ماتریکس مورد استفاده و ممانعت‌های فضایی و تعاملی موجود در حین جداسازی اشاره کرد. به‌طور معمول، جداسازی DNA با استفاده از روش‌های استخراج ستون تجاری انجام می‌شود اما هنگامی که سلول‌ها به‌صورت سه بعدی کشت می‌شوند، ویژگی‌های ماتریکس‌های سه بعدی می‌تواند از جداسازی و پالایش مناسب نمونه‌ها در ستون جداسازی DNA ممانعت کند. این امر به نوبه‌ خود باعث کاهش بازده استخراج DNA و افت کیفیت آن می‌گردد. با این‌حال، با انتخاب یک دستور کار مناسب و استفاده از ماتریکس کشت سه بعدی بهینه امکان جداسازی DNA برای تهیه کتابخانه NGS فراهم می‌شود.

جداسازی DNA و NGS سرطان کلیه

 شکل زیر، PDCهایی را نشان می‌دهد که به‌صورت سه‌بعدی در GrowDex کشت داده شده‌اند. در این مطالعه، رشد PDC‌های کلیوی به‌صورت دو بعدی (کشت تک لایه) و سه بعدی و با استفاده از ماتریکس‌های مختلف بهینه شده‌ است. این ماتریکس‌ها شامل GrowDex -هیدروژل سلولزی مبتنی بر گیاه- هستند که اخیراً به‌عنوان یک بستر رشد مناسب در کشت سه بعدی سلول‌های مختلف مورد استفاده قرار می‌گیرد. این هیدروژل عاری از موجودات، تمیز و قابل تنظیم است که می‌تواند با استفاده از آنزیم سلولاز و بدون آسیب به سلول‌های انسانی تخریب شود. اگر چه ماتریکس مورد استفاده برای حمایت از رشد سه‌ بعدی PDCها می‌تواند از خالص‌سازی مبتنی بر ستون DNA قبل از توالی‌یابی ژنوم ممانعت کند اما با استفاده از کشت سه ‌بعدی PDCها در GrowDex، بازده توالی‌یابی کامل اگزوم افزایش می‌یابد.

محققان به‌منظور ارزیابی و مقایسه یافته‌های حاصل با گروه شاهد، NGS را برای سلول‌های کشت شده در یک مجموعه کشت سنتی و تک لایه دو بعدی مورد بررسی قرار داده‌اند. پس از مدت زمان کوتاهی، نمونه‌‌‌های بافت توموری کلیه تفکیک شدند. سپس نمونه‌ها به‌صورت دو بعدی و با توجه به پروتکل‌های منتشر شده و یا در هیدروژل GrowDex 0.4 درصد موجود در محیط کشت کامل کشت داده شدند. در واقع کشت‌ها در پلیت‌های سلولی 24 یا 96 خانه‌ای انجام شد. در مرحله بعد برای حذف GrowDex، از آنزیم سلولاز گروداز (GrowDase) و برای جداسازی DNA از کیت استخراج دینابیدز Dynabeads) DNA) استفاده شد. سپس، 150 نانو گرم از DNA برای تهیه کتابخانه ژنومی مورد استفاده قرار گرفت.

توالی‌یابی اگزوم با استفاده از Roche HyperCap MedExome و تعیین توالی کتابخانه‌های به‌دست آمده با استفاده از پلت‌فرم توالی‌یابی Illumina Hiseq2500 انجام شد. در نهایت تجزیه و تحلیل توالی‌ها و فراخوانی متغیرها با بهره‌گیری از ابزارهای In-house ارائه گردید. فراخوانی متغیر فرایندی است که توسط آن متغیرهای داده‌های توالی شناسایی می‌شوند.

یافته‌های این مطالعه نشان می‌دهند که حذف ماتریکس سه بعدی برای استخراج کارآمد DNA از سلول‌های کشت‌شده سه بعدی با استفاده از کیت‌های جداسازی دینابیدز ضروری است. تیمار سلول‌ها با آنزیم گروداز باعث آزادسازی مؤثر اسفروئیدهای PDC از هیدروژل GrowDex و پردازش قوی اسفروئیدهای ترکیب‌شده با دینابیدزهای موجود در رک‌های مغناطیسی می‌شود. همچنین موفقیت در ثبت و ضبط اگزوم به میزان و کیفیت DNA ورودی بستگی دارد.

به‌طور کلی، این روش برای استخراج DNA از PDCهای سه‌ بعدی کشت‌شده در GrowDex بازده بالایی را تخمین می‌زند که برای WES و یا هر نوع روش NGS دیگر کافی است. استخراج DNA از کشت‌های سه بعدی محققان را قادر می‌سازد تا داده‌های WES را با وضوح سوماتیک (میانگین پوشش هدف> x80) ارائه دهند. مقایسه نتایج حاصل از تعیین توالی‌ در سطح کروموزوم و مشاهده‌گر ژنومیک یکپارچه (Integrated Genomics Viewer)، نشان‌دهنده هم‌پوشانی قابل‌توجه توالی‌های DNA استخراج‌شده از PDC‌های کشت‌شده تک لایه دو بعدی بر روی پلاستیک (کشت سنتی) و PDC‌های کشت‌شده سه بعدی در GrowDex بود. مشاهده‌گر ژنومیک یکپارچه یک ابزار تجسمی نمایشی کارامد است که برای شناسایی تعاملات موجود در مجموعه داده‌های ژنومی بزرگ و یکپارچه مورد استفاده قرار می‌گیرد.

خلاصه و نتیجه‌گیری

با این مطالعه نتیجه می­شود که استفاده از روش‌های جدید کشت سه بعدی PDCها باعث توانمندتر شدن فیزیولوژیک مدل‌های سرطانی خارج از بدن می‌شود. تعیین توالی ژنومی سریع و مقرون به‌صرفه PDCها برای تعیین مشخصات سلول‌‌ها و اجرای بالینی نتایج غربالگری اثربخشی داروها در PM ضروری است. در این مطالعه، سلول‌های مشتق‌شده از بیماران مبتلا به سرطان کلیه به‌صورت سه بعدی در GrowDex کشت داده شدند و برای لیز و بازیابی DNA مبتنی بر بید مورد استفاده قرار گرفتند. این امر با کمک آنزیم سلولاز و با تخریب شبکه نانو فیبریل سلولز انجام شد. از سوی دیگر، در جداسازی DNA از مراحل خالص‌سازی دیگری نیز استفاده گردید. همچنین مقدار و کیفیت  DNAاستخراج‌شده برای تهیه کتابخانه ژنومی NGS و توالی‌یابی اگزوم کافی بود. در نهایت می‌توان گفت توسعه پروتکل‌های سنجش سریع، آسان و بهینه برای اسفروئیدها و ارگانوئیدهای PDCهای سه بعدی، استفاده از آن‌ها را در کاربردهای PM، کشف دارو و سایر فعالیت‌های مربوطه بهبود خواهد بخشید.

این دیدگاه در تاریخ 17 سپتامبر2019 در وب سایت Drug target review منتشر شده‌است.

نویسندگان دیدگاه:

1- Lauri Paasonen محقق برنامه‌های کاربردی در UPM Biomedicals، هلسینکی فنلاند است که روی محصول کشت سلولی 3D و توسعه برنامه‌های کاربردی فعالیت می‌کند. وی دارای دکترای علوم دارویی از دانشگاه هلسینکی فنلاند است.

2- Vilja Pietiäinen محقق ارشد در انستیتوی پزشکی مولکولی فنلاند. تحقیقات او روی پزشکی سیستم‌ها و درمان‌های دقیق سرطان متمرکز است. وی مدرک کارشناسی ارشد بیوشیمی دانشگاه ادینبورگ، انگلستان و دارای دکترای ویروس‌شناسی/ زیست شناسی سلولی دانشگاه هلسینکی-UH، فنلاند است.

توسط
Drug target review
برچسب‌ها
نمایش بیشتر

نوشته‌های مشابه

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

دکمه بازگشت به بالا
EnglishIran
بستن
بستن