توسعه محصولات یاروویا لیپولیتیکا با زیست شناسی مصنوعی

مخمر روغنی و غیرمتعارف یاروویا لیپولیتیکا، در حوزه تولید محصولات زیستی توجه زیادی را به خود جلب کرده است. این میزبان تمایل زیادی برای تولید مواد واسط چرخه TCA و پیش‌ماده‌های مهمی چون استیل-کوآنزیم‌آ و مالونیل-کوآنزیم‌آ دارد؛ به همین دلیل به کمک زیست‌شناسی مصنوعی می‌تواند گزینه مناسبی برای تولید مواد شیمیایی صنعتی باشد.

یاروویا لیپولیتیکا به عنوان میزبان تولید صنعتی

مهندسی متابولیک مسیر آسانی را برای تولید مواد شیمیایی ضروری ایجاد کرده است. بهره‌گیری از پیشرفت‌های هم‌زمان در زیست‌شناسی مصنوعی، سرعت مهندسی سویه و صنعتی‌سازی میکروب‌ها را افزایش می‌دهد. از این نظر، سامانه‌های قارچی (متعارف و غیر متعارف) به عنوان میزبانی منحصر به فرد شناخته می‌شوند. در این بین، مخمر روغنی یاروویا لیپولیتیکا به خاطر پیشرفت در ابزار‌های زیست‌شناسی مصنوعی و انعطاف‌پذیری متابولیکی، به میزبانی با توانایی‌های منحصر به فرد تبدیل شده است. مطالعات زیادی برای کشت این میکروارگانیسم مجاز (GRAS) روی انواع مواد شیمیایی، هیدروکربن‌ها، ضایعات کربنی و نیز برای تولید پروتئین‌های برون سلولی وجود دارد. با تلاش پژوهشگران شرکت‌های Codexis ،DuPont ،Microbia و Pfizer؛ مخمر یاروویا لیپولیتیکا رکورد دار تولید صنعتی لیپاز و لیپید‌های جانشین روغن ماهی است.

در سال‌های اخیر یاروویا لیپولیتیکا به خاطر قابلیت‌های ذکر شده و پتانسیل‌های متابولیکی، در صنعت و دانشگاه به عنوان یک میکروارگانیسم میزبان مناسب شناخته می‌شود. با این حال، با توجه به تمایل به پیوستن نهایی غیر متجانس (non-homologous end joining – NHEJ) و سامانه‌های پلاسمید اپیزومی نسبتاً ناپایدار، چالش‌های بعدی در مسیر این مخمر باقی می‌مانند. در ادامه پیشرفت‌های زیست‌شناسی مصنوعی برای غلبه بر این چالش‌ها در جهت تولید ترکیبات شیمیایی روغنی، اسیدهای آلی، غذادارو و مواد شیمیایی ویژه بررسی می‌شود.

پیشرفت‌های اخیر در مهندسی متابولیک یاروویا لیپولیتیکا

یاروویا لیپولیتیکا تمایل منحصر به فردی برای تولید استیل- کوآنزیم‌آ و مالونیل- کو آنزیم‌آ دارد. این مواد در ادامه مسیر متابولیکی، به انواع مختلفی از محصولات تبدیل می‌شوند. علاوه براین، توانایی این مخمر برای مصرف انواع مواد کربنی یکی دیگر از ویژگی‌های رقابتی برای استفاده از این میزبان است. به عنوان مثال، یاروویا لیپولیتیکا مهندسی شده می‌تواند فسفیت را جذب و در کشت روی مواد ارزان قیمت، بر دیگر سویه‌های آلوده کننده غلبه کند. در ادامه، پیشرفت‌های اخیر در زمینه‌های تولید ترکیبات شیمیایی روغنی، اسیدهای آلی، غذادارو و مواد شیمیایی ویژه بررسی خواهد شد.

تولید ترکیبات شیمیایی روغنی از یاروویا لیپولیتیکا

یاروویا لیپولیتیکا به عنوان یک مخمر روغنی، گزینه مناسبی برای میزبانی تولید انواع لیپید و مشتقات آن (اسیدهای چرب عامل‌دار، الکل‌های چرب و روغن تک‌سلولی) است. پیشرفت‌های اخیر در جهت‌دهی به تولید کوفاکتورها (برای افزایش بازدهی) و فهم فرآیند تشکیل لیپید و تنظیم‌کننده‌های متابولیکی، تولید لیپید و محصولات وابسته به آن را بهبود داده است. با این کار، قابلیت تولید تری آسیل گلیسرول‌ها، اسیدهای چرب آزاد و الکل‌های چرب به ترتیب تا 100، 10 و 2 گرم بر لیتر افزایش می‌یابد که در مقایسه با توانایی تولید سویه‌ اولیه، بسیار بیشتر است. مطالعات جدیدتری نیز برای فهم اساسی تشکیل لیپید وجود دارد. در یکی از این پژوهش‌ها، یک انگشت روی از مدل سیس2 هیس2 (Cys2His2-type zinc-finger protein) شناسایی شده است که از بین رفتن آن، باعث مسیربندی مجدد برای تشکیل لیپیدها می‌شود. این مطالعات پتانسیل یاروویا لیپولیتیکا را برای تولید ترکیبات شیمیایی روغنی نشان می‌دهد.

تولید اسیدهای آلی از یاروویا لیپولیتیکا

ماهیت روغنی بودن یاروویا لیپولیتیکا از فعالیت بالای چرخه TCA در این مخمر ناشی می‌شود. از این صفت می‌توان برای تولید یک ماده مهم در صنایع غذایی، دارویی و مواد شیمیایی، یعنی اسید سیتریک استفاده کرد. در بسیاری از موارد با ایجاد شوک کاهش نیتروژن، می‌توان تولید اسید سیتریک را با تخمیر منابع ارزان قیمت کربنی بهبود داد. پژوهش‌های اخیر روی توضیح ساز و کاری تمرکز دارد که با استفاده از آن می‌توان تولید بیش از حد سیتریک اسید را از گلوکوز امکان‌پذیر کرد. علاوه بر سیتریک اسید، مهندسی متابولیک، مسیر سوخت و ساز را به سمت تولید بیشتر مواد میانی مثل آلفا- کتوگلوتاریک اسید، پیروییک اسید، سوکسینیک اسید و ایتاکونیک اسید سوق داده است.

تولید غذادارو از یاروویا لیپولیتیکا

مجاز بودن (GRAS) یاروویا لیپولیتیکا سبب شده است تا از این میزبان برای تولید غذادارو، مثل کارتنوئید‌ها استفاده شود. پژوهش شرکت‌های DuPont و Microbia نشان داد که می‌توان چهار نوع کارتنوئید (لیکوپن، بتاکاروتن، زیگزانتین و کانتاگزانتین) را در مقادیر قابل ملاحظه (374 میلی‌گرم بر گرم سلول خشک) از این مخمر تولید کرد. در پژوهش های بعدی برای تولید لیکوپن، با بیان آنزیم‌های محدود کننده‌ نرخ تولید و نیز با استفاده از تحلیل‌های تعادل شار، بازدهی تولید این محصول افزایش یافت. این سویه می‌تواند در شرایط نیمه منقطع تا 6.5 گرم بر لیتر بتاکاروتن تولید کند. ادامه‌ کارهای مهندسی روی سویه‌های تولید کننده بتاکاروتن از این مخمر، در راستای تولید محصولاتی چون آستاگزانتین، کاتاگزانتین و اکیننون (Echinenone) خواهد بود.

علاوه بر کارتنوئیدها، پژوهش‌های فراوانی روی یاروویا لیپولیتیکا برای تولید اریتریتول (شیرین‌کننده غذایی) انجام گرفته است. در تحقیقات اولیه، قابلیت تولید مناسب این ماده از گلیسرول خام با به کارگیری سویه‌های جهش یافته‌ یاروویا لیپولیتیکا مشخص شد. با مهندسی‌های بعدی که روی سویه‌ها انجام گرفت، مقدار و بهره‌وری تولید اریتریتول افزایش یافت. این پژوهش‌ها یک اریتروز ردوکتاز و عامل مصرف‌کننده‌ اریتریتول را در مسیر سوخت و ساز شناسایی کرد که هدف مهندسی متابولیسم در پژوهش‌های بعدی خواهد بود.

تولید ترکیبات شیمیایی ویژه از یاروویا لیپولیتیکا

پژوهش‌های متنوعی روی تولید انواع ترکیبات شیمیایی ویژه از یاروویا لیپولیتیکا انجام گرفته است. به عنوان نمونه می‌توان به تولید اریترولوز از اریتریتول اشاره کرد. اریترولوز به راحتی به گلیسرآلدهید استونید (glyceraldehyde acetonide) که خود یک پیش‌ماده برای تولید انواع مواد دارویی است، تبدیل می‌شود. کمپسترول (campesterol) پیش‌ماده‌ دارویی دیگری است که بعد از غربالگری 7- دهیدروکلسترول ردوکتازها در مهندسی سویه یاروویا لیپولیتیکا، به مقدار قابل ملاحظه‌ای از موالونات تولید شد.

لینالول محصول دیگری است که با وارد کردن یک مسیر سنتزی به این میکروارگانیسم با موفقیت تولید گردید. در نهایت، پژوهشگران توانستند استیل- کوآنزیم‌آ و مالونیل- کوآنزیم‌آ را که برای تولید لیپید در سویه استفاده می‌شود، برای تولید پلی‌کتیدها به کار بگیرند. به عنوان نمونه در نتیجه این تلاش‌ها، تولید تری استیک اسید لاکتون در سویه مهندسی شده به 36 گرم بر لیتر رسید. این تلاش‌ها نشان می‌دهد که یاروویا لیپولیتیکا میزبان مناسبی برای تولید صنعتی انواع ترکیبات شیمیایی ویژه است.

توسعه تجهیزات سنتزی برای مهندسی یاروویا لیپولیتیکا

تبدیل یک مخمر غیرمتعارف مثل یاروویا لیپولیتیکا به یک مخمر اصلی و پایه، هم نیازمند پتانسیل‌های صنعتی و هم نیازمند بهبود تجهیزات ژنتیکی و سنتزی است. رویکردهای اولیه برای انتقال، در مقایسه با مخمر میزبانی مثل ساکارومایسس سرویزیه هم‌چنان محدود است. بعد از ثبت اختراع شرکت Pfizer در سال 1992 برای انتقال در مورد یاروویا لیپولیتیکا، پیشرفت‌های بعدی در زمینه افزایش نرخ انتقال، شامل روش‌های توان بالا در پلیت میکروتیتر صورت گرفت. در هرصورت سرعت انتقال نهایی هنوز بسیار کمتر از سرعت انتقال در مخمر ساکارومایسس سرویزیه است. بر خلاف این بازدهی پایین، رویکردهای جدید برای اجزاء ژنتیکی و هم‌چنین سامانه‌های کریسپر Cas9، تجهیزات ساخت DNA و طراحی مبتنی بر مدل، استفاده از این میزبان را توسعه داده است.

بیان دقیق ژن با اجزا سنتزی جدید یاروویا لیپولیتیکا

مهندسی مستقیم سویه به مجموعه وسیعی از عوامل کنترل مصنوعی نیاز دارد. این حوزه برای یاروویا لیپولیتیکا پیشرفت‌هایی در اجزا شامل راه‌انداز ژن (پروموترها) و پایان‌دهنده‌ها (terminators) داشته است. در آغاز، راه‌اندازهای طبیعی میکروارگانیسم مطالعه و مشخص شد که بیان آن‌ها سطوح مختلفی دارد. کارهای اولیه با استفاده از رویکرد راه‌انداز هیبریدی، دو توالی فعال‌سازی بالادست (upstream activating sequences- UASs) مربوط به ژن XPR2 را شناسایی کرد (UAS1 و UAS2). در این راستا، پژوهشگران نشان دادند که با جفت کردن تعداد زیادی از دوگانه‌های US1 کوتاه شده (با نام US1B)، می‌توان فعالیت راه‌انداز را افزایش داده و بیان ساختاری را در شرایط مختلف بیان بهبود بخشید. تلاش‌های بعدی روی کوتاه کردن عوامل بومی راه‌انداز، در راستای تشخیص بخش اصلی UAS تمرکز داشت. بنابراین، یک توالی قوی (UAS-TEF (translation elongation factor شناسایی شد که می‌تواند صرف‌نظر از شرایط کشت، با عامل UAS1B پیوند داده و یک راه‌انداز ساختاری قوی تشکیل دهد.

در سطح دوم کنترل، راه‌اندازهای القایی، یک بعد کنترل زمانی به بیان ژن اضافه کرد که با استفاده از آن، رشد و تولید محصول در کشت صنعتی از هم جدا می‌شود. به این منظور، پژوهشگران از یک رویکرد راه‌انداز هیبریدی یکسان استفاده کردند. به این ترتیب، با به کارگیری یک UAS از راه‌انداز بومی POX2 (القایی با اولئیک اسید)، راه‌اندازهای قوی ایجاد می‌کنند که با اولئیک اسید خارجی القاء می‌شود. ایراد این روش اولیه، عملکرد ضعیف در محیط گلوکزی بود که با بهبود‌های بعدی که روی راه‌انداز POX2 صورت گرفت، القاء با اولئیک اسید 48 برابر افزایش یافت. این عامل القاء شونده تقریباً بدون قاعده عمل کرده و با دیگر لیپیدها نیز القاء می‌شود.

رویکردهای مشابه برای شناسایی و جفت کردن اجزاء پاسخ‌دهنده به متابولیت، علاوه بر القاء با لیپید، باعث گسترش امکان القاء با استفاده از آلکان و اریتریتول شده است. به عنوان مثال، اجزاء راه‌انداز ALK1 که پاسخ‌دهنده به آلکان بوده و با ان- دکان القاء می‌شود، در این مخمر شناسایی شده و برای القاء پنج برابری جفت شده است. به طور مشابه، جزئی از راه‌انداز EYK1 شناسایی شده که در آن عملیات القاء وابسته به مقدار اریتریتول و اریترولوز انجام می‌گیرد. این ویژگی امکان القاء دقیق‌تری را نسبت به راه‌اندازهای وابسته به آلکان و لیپید برای پژوهشگران فراهم می‌آورد.

روش‌های القاء دقیق به راه‌اندازها محدود نشده و پایان‌دهنده‌ها را نیز در بر می‌گیرد. برای سامانه‌های قارچی، پایان دهنده‌ها معمولاً با تغییر پایداری و نیمه‌عمر mRNA، می‌توانند بازدهی پروتئین و فراوانی آنزیم را بهبود دهند. گرچه، پایان‌دهنده‌ها برای یاروویا لیپولیتیکا هنوز به طور کامل شناسایی نشده‌اند؛ با این حال، طراحی‌های مصنوعی که برای ساکارومایسس سرویزیه انجام گرفته است، برای یاروویا لیپولیتیکا نیز قابلیت اجرا دارد؛ به طوری که در مقایسه با پایان‌دهنده‌های طبیعی این مخمر، القاء ژن 70 درصد بهبود می‌یابد.

افزایش بازدهی به هم پیوستگی در یاروویا لیپولیتیکا با کریسپر Cas9

بیشتر روش‌های سنتی در مهندسی ژن برای یاروویا لیپولیتیکا، روش‌های NHEJ هستند که در آن، ادغام DNA خارجی به صورت تصادفی و هنگام ترمیم صورت می‌گیرد. پایداری این روش در بلند مدت مناسب نبوده و باعث ناکارامدی سویه مورد نظر می‌شود. در سال‌های اخیر، فناوری کریسپر روش ساده‌ای را برای مهندسی مخمرهای غیر متعارف ایجاد کرده است.

این کار برای اولین بار توسط شرکت DMS با استفاده از راه‌اندازهای RNA پلیمراز III (یا Pol III) و RNA پلیمراز II TEF صورت گرفت. در این روش، با استفاده از ریبوزوم‌های سرچکشی و ریبوزوم‌های ویروس HDV القاء sgRNA کنترل شد. پژوهش‌های دیگری با استفاده از فناوری کریسپر برای بهبود ادغام DNA در مخمر یاروویا لیپولیتیکا صورت گرفته که عملکرد بهتر آن‌ها به بهینه‌سازی نیاز دارد.

پیشرفت فناوری کریسپر Cas9 سبب بهبود روش‌ها در حوزه‌ کار با مخمر می‌شود. به عنوان مثال، پژوهشگران دو سامانه‌ جدا از هم توسعه داده‌اند که یکی از آن‌ها می‌تواند ادغام ژن‌های هدفمند و بدون نشانگر را میسر کند و سامانه دوم، باعث سرکوب ژن واسط کریسپر می‌شود. در مثال اول، پنج جایگاه شناسایی شد که می‌توانند به عنوان نقاط کانونی دسترسی سریع عمل کنند. در مورد دوم نیز با استفاده از یک ترکیب dCas9-Mxi، پروتئین‌های KU70 و KU80 برای سرکوب هدف‌گذاری شدند که در نتیجه‌ آن، فراوانی تعداد سلول‌های انتخاب شده با نوترکیبی همسان افزایش می‌یابد. این سرکوب به صورت موقت کنترل شده و با از بین بردن پلاسمیدی که سامانه dCas9 را کدگذاری می‌کند، معکوس می‌شود.

ابزارهای بازسازی DNA برای آزمایش سریع مسیرهای متابولیکی یاروویا لیپولیتیکا

در راستای استاندارد کردن همتاسازی، ابزارهایی برای همتاکردن وکتورها و یکپارچه‌سازی ژن‌ها در جایگاه مشخص شده در مخمر یاروویا لیپولیتیکا به وجود آمده است. اولین استفاده از یک روش بازسازی DNA چند ژنی برای این مخمر، در سال 2014 گزارش شده است. در این آزمایش، نوترکیبی همسان و در بافت طبیعی در یک مرحله انجام گرفت تا سه ژن دربرگیرنده‌ مسیر تولید بتاکاروتن را به یک نشان‌گر انتخاب مثبت الصاق کنند. این ساختار چهار ژنی، با موفقیت و با بازدهی 21 درصد به ژنوم متصل شد.

به تازگی، بازسازی و ایجاد مسیر متابولیکی با استفاده از طرح Golden Gate DNA assembly بهبود یافته است. این روش از لحاظ هزینه و زمان به صرفه‌ تر بوده و موفقیت آن برای یاروویا لیپولیتیکا نسبت به روش‌های نوترکیبی همسان بیشتر است. پژوهشگران بازدهی بین 67 الی 90 درصدی را برای این روش گزارش کرده‌اند. به عنوان جایگزین روش Golden Gate، بازسازی چند جزئی پیمانه‌ای توسعه داده شده و با استفاده از استانداردهای BioBrick مورد آزمایش قرار گرفته است. برخی از پژوهش‌ها تأثیر مثبت این روش را برای تولید یک رنگ‌دانه در یاروویا لیپولیتیکا گزارش می‌کند. یک روش همتاسازی نهایی به نام Easy Clone YALI که از فناوری کریسپر Cas9 استفاده می‌کند، ادغام بدون نشان‌گر را برای بیش از پنج وکتور در جایگاه مشخص، با بازدهی بیش از 80 درصد ممکن ساخته است.

آینده‌ مهندسی متابولیک در یاروویا لیپولیتیکا با رویکردهای مبتنی بر مدل

پیشرفت‌های ذکر شده در مهندسی متابولیک و زیست‌شناسی مصنوعی برای یاروویا لیپولیتیکا با فناوری‌های پیشرفته اُمیکس و مهندسی مبتنی بر مدل در این میزبان کامل می‌شود. این حوزه برای استفاده از رویکردهای مبتنی بر مدل و در راستای فهم بهتر و پیش‌بینی مسیر سوخت و ساز ایجاد شده است. اولین مطالعات یکپارچه روی یاروویا لیپولیتیکا، شامل توسعه‌ یک مدل متابولیکی در مقیاس ژنوم به همراه متابولومیک و لیپیدمیک است که در آن ارتباط بین شرایط مختلف رشد و تشکیل لیپیدها مشخص می‌شود. این مطالعه، نقش تنظیمی سنتز آمینو اسید را روی تشکیل لیپید نشان می‌دهد. بر این اساس، حالت متابولیسم لیپید بسیار شبیه به متابولیسم سرریز اتانول در ساکارومایسس سرویزیه است.

مدل‌های جامع دیگری از تنظیم ژن، شش تنظیم‌کننده اصلی متابولیسم لیپید را شناسایی و با انجام آزمایش تأیید کرده است. این شش تنظیم‌کننده، از طریق ساخت یک شبکه‌ تنظیم مشترک در ابعاد ژنوم، تنوع گسترده‌ای را در نحوه تجمع چربی‌ها ایجاد می‌کنند. استفاده از مدل‌های مقیاس ژنوم و درک جامع از متابولیسم، سبب بهبود مهندسی متابولیک در یاروویا لیپولیتیکا شده است.

چشم‌انداز مهندسی یاروویا لیپولیتیکا

مخمر غیر متعارف یاروویا لیپولیتیکا به سرعت در حال تبدیل شدن به یک میکروارگانیسم مدل با کاربردهای فراوان در مهندسی متابولیک است. این مخمر به خاطر ویژگی‌های ممتازی مانند فعالیت بالای چرخه TCA، میزبان مناسبی برای تولید انواع مواد شیمیایی محسوب می‌شود. با اینکه پیشرفت‌های چشمگیری در این زمینه صورت گرفته است، اما چالش‌های فراوانی شامل بهبود کارایی تبدیل، ساخت وسایل جدید ژنتیکی، استفاده کامل از فناوری کریسپر و نیاز به مدل‌های توصیفی بیشتر برای این میکروارگانیسم وجود دارد. مقبولیت سریع یاروویا لیپولیتیکا به عنوان یک میزبان مناسب در مجامع دانشگاهی و صنعتی، این امید را به وجود می‌آورد که در سال‌های آینده این میزبان می‌تواند مسیر جدیدی را برای تولید محصولات در مقیاس صنعتی ایجاد کند.

این مطلب در 4 ژوئن 2018 در مجله Trends in Biotechnology منتشر شده است.
☑ نویسنده: .Markham Kelly A

☑ منبع