مدلسازی متابولیکی میکروجلبک ها و آخرین پیشرفت های آن

تولید سوخت‌های زیستی توسط میکروارگانیسم‌ها، مانند میکروجلبک، یک جایگزین امیدبخش برای سوخت‌های تجدیدناپذیر است. چندین گونه جلبک به‌دلیل قابلیت متابولیک خود برای انباشت مقادیر زیاد لیپید، به‌عنوان نمونه‌های مناسب برای تولید سوخت‌های زیستی مورد بررسی قرار گرفته‌اند. اخیراً مدلسازی متابولیکی میکروجلبک ها بسیار توسعه یافته است.

میکروارگانیسم‌های فتوسنتزکننده به‌عنوان یکی از قدیمی‌ترین شکل‌های حیات روی زمین شناخته می‌شوند. این ارگانیسم‌ها شامل میکروجلبک مانند Chlamydomonas sp ،Synechocystis sp و Chlorella sp به‌دلیل قابلیت تبدیل منابع تجدیدپذیر (دی‌اکسید کربن، نور و آب) به زیست‌توده و مواد اولیه سوخت، توجه زیادی را از صنعت بیوتکنولوژی به خود جلب کرده‌ است. زیست‌توده و متابولیت‌های تولیدشده را می‌توان برای سنتز پایین‌دست سوخت‌ها (به‌عنوان مثال اتانول و بیودیزل) و مواد شیمیایی پرکاربرد (مانند رنگدانه‌ها و اسیدهای آلی) مورد استفاده قرار داد.

میکروجلبک‌ها بهترین گزینه برای تولید سوخت زیستی

نیاز روزافزون جهان به انرژی و سوخت ارزان، نیازمند بهبود مداوم روش‌های تولید جهت پاسخگویی به تقاضا است. از طرف دیگر افزایش مصرف سوخت منجر به افزایش انتشار جهانی گازهای گلخانه‌ای شده‌ است. ​انتشار گازهای گلخانه‌ای، سبب افزایش شدید میزان گاز دی‌اکسید کربن از ۲۸۰ پی‌پی‌ام قبل از انقلاب صنعتی تا ۴۰۷ پی‌پی‌ام شده‌ است. بیش از ۷۵ درصد از انتشار دی‌اکسید کربن به سوزاندن سوخت‌های فسیلی نسبت داده شده‌ است، به طوری‌که امروزه مسئله کاهش رد پای کربن، به‌عنوان یکی از چالش‌های بزرگ فناوری شناخته می‌شود. یکی از راه‌های مقابله با این چالش، استفاده از سوخت‌های زیستی تولیدشده از منابع تجدیدپذیر است که در نتیجه تلاش‌های قابل‌توجهی برای بهبود بهره‌وری تولید سوخت‌های زیستی مختلف در حال مطالعه است.

سوخت‌های زیستی بسته به نوع ماده خام که برای تولید آن‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد، به سوخت‌های زیستی نوع اول، دوم و سوم تقسیم می‌شوند. سوخت‌های زیستی نسل اول از محصولات کشاورزی تولید می‌شوند. یک نمونه از آن تولید اتانول زیستی از نیشکر است. این سوخت‌های زیستی به‌طور گسترده مورد انتقاد قرار گرفته‌اند، چرا که این محصولات مورد تقاضای مصرف انسان است و استفاده از آن به‌عنوان سوخت باعث کاهش عرضه آن‌ها و درنتیجه افزایش قیمت خواهد شد.

تولید سوخت از بخش‌های غیرقابل خوردن مواد غذایی، مانند سوخت‌های زیستی تولیدشده از زیست‌توده لیگنوسلولزی به‌عنوان جایگزینی برای سوخت‌های زیستی نوع اول مطرح شده‌ است. این سوخت‌ها که به سوخت‌های زیستی نوع دوم شناخته می‌شوند، نیازمند زمین‌های حاصلخیز و اغلب مقدار قابل‌توجهی آب برای آبیاری هستند و از طرف دیگر محدود بودن مناطق قابل تولید، این نوع سوخت زیستی نیز با محدودیت‌هایی روبرو است.

از این رو، سوخت‌های زیستی نسل سوم، یعنی تولید پایدار سوخت زیستی توسط میکروجلبک به‌عنوان جایگزینی برای سوخت‌های نوع اول و دوم مورد بررسی قرار گرفته‌اند. سوخت‌های زیستی نسل سوم نیز با مشکلات متعددی روبرو هستند که باید قبل از تبدیل شدن به یک جایگزین مناسب اقتصادی، این مشکلات را برطرف کرد.

یکی از بزرگ‌ترین چالش‌ها برای سوخت‌های زیستی نسل سوم از میکروارگانیسم‌های فتوسنتزی، در فرایند برداشت و جداسازی بخش پایین‌دست ترکیبات مورد نظر است. به‌عنوان مثال، فرایند جداسازی لیپیدها از زیست‌توده میکروجلبک، حدود 50 درصد از هزینه‌های تولید را شامل می‌شود که پرهزینه‌بودن روش‌های فعلی، باعث گران‌شدن هزینه تولید سوخت زیستی نسل سوم و غیراقتصادی‌شدن آن می‌شود. اگر زیست‌توده میکروجلبک حاوی مقدار بالاتری از لیپید باشد، می‌توان این هزینه سرسام‌آور بخش جداسازی را جبران کرد و به‌طور گسترده از سودآوری و قابلیت استفاده از میکروجلبک برای تولید سوخت زیستی نسل سوم سود برد.

یک مطالعه اولیه توسط وزارت انرژی امریکا در سال ۱۹۷۸ بیان می‌کند که لازم است محتوای لیپید در زیست‌توده میکروجلبک حداقل ۶۰ درصد باشد که تولید سوخت زیستی از نظر اقتصادی توجیه‌پذیر شود. این عدد در حال حاضر بسته به شرایط سویه میکروجلبک و همچنین شرایط کشت چیزی در حدود ۲۰ تا ۴۰ درصد است. به این ترتیب این موضوع سبب شده است که افزایش محتوای لیپید این میکروارگانیسم‌ها به‌عنوان یکی از کانون‌های اصلی مورد توجه در مطالعات صنعت سوخت زیستی باشد.

تلاش‌های عمده‌ای برای بهبود میزان لیپید از طریق بهینه‌سازی شرایط کشت و طراحی‌های پیشرفته مهندسی سویه متمرکز شده‌ است، که در هر دو راهبرد مذکور از مدلسازی متابولیکی استفاده می‌شود. در این دیدگاه، روش‌های محاسباتی مختلف مورد استفاده برای طراحی سویه‌ها و محیط‌های کشت شامل آنالیز موازنه شار (FBA)، آنالیز موازنه شار دینامیکی (dFBA)، آنالیز شار متابولیک کربن 13، حالت‌های ابتدایی (EM) و چند روش دیگر مورد مقایسه قرار می‌گیرند.

آشنایی با میکروارگانیسم‌های فتوسنتزی

میکروجلبک‌ها در طول تاریخ به دو دسته تقسیم شده‌اند: میکروجلبک باکتریایی (سیانوباکتری‌ها) و میکروجلبک یوکاریوتی. میکروجلبک‌های یوکاریوتی شامل جلبک‌های سبز (Chlorophyta)، جلبک‌های قرمز (Rhodophyta) و دیاتومه‌ها (Bacillariophyta) است.

ویژگی شاخص برای همه میکروجلبک‌ها توانایی آن‌ها در رشد به‌صورت فتوآتروفی با دی‌اکسید کربن و نور به‌عنوان تنها منابع کربن و انرژی است. چندین جلبک نیز قادر به رشد به‌صورت هتروتروفی در غیاب نور با استفاده از سوبستراهای آلی مختلف، یا رشد میکسوتروفی هستند. منظور از رشد میکسوتروفی جذب کربن آلی (به‌عنوان مثال، گلوکز، ساکارز یا استات) در طول رشد در حضور نور است.

به‌دلیل توانایی میکروجلبک‌ها در دستیابی به تولید قابل توجه لیپید که در برخی گونه‌ها از 20 درصد کل زیست‌توده در وزن خشک و برخی گونه‌ها تا بیش از 60 درصد (یعنی رسیدن به قابلیت اقتصادی) فراتر می‌رود. برخی مطالعات، بهره‌وری لیپید را در حدود سالانه ۱۳۶،۹۰۰ لیتر در هکتار گزارش کرده‌اند که این میزان تولید چربی، چندین برابر بیشتر از تولید مزارع پالم روغنی در این مقیاس یعنی حدود سالانه ۲۲،۷۸۰ لیتر در هکتار است. همچنین میکروجلبک برای تولید سوخت‌های زیستی غیرمبتنی بر لیپید نیز مورد بررسی قرار گرفته‌ است. چندین جنس از میکروجلبک‌ها برای تولید سوخت زیستی استفاده شده‌اند و مدل‌های متابولیکی در حال حاضر برای ارگانیسم‌هایی مانند Chlamydomonas ،Chlorella ،Nannochloropsis Synechocystis ،Tetraselmis Monoraphidium ،Ostreococcus ،Tisochrysis و Phaeodactylum وجود دارد.

علاوه بر این جهش ژنتیکی چندین میکروجلبک از جمله Chlamydomonas ،Synechocystis و Phaeodactylum نیز با استفاده از ابزار مدلسازی متابولیکی مورد مطالعه قرار گرفته است. مدل‌های متابولیک، دستیابی به اطلاعات کلیدی در مورد متابولیسم مرکزی کربن میکروجلبک، وابستگی رشد آن به مواد مغذی و توزیع واکنش‌ها در اندامک‌های مختلف این موجودات زنده را ممکن ساخته است.

مدلسازی متابولیکی ​میکروجلبک

روش‌های مدلسازی مختلفی برای بهبود قابلیت کاربرد میکروارگانیسم‌ها برای کاربردهای صنعتی به‌کار گرفته شده‌اند. تلاش‌های مدلسازی را می‌توان در رویکردهای مبتنی بر برچسب‌گذاری ایزوتوپ، سینتیک و محدودیت طبقه‌بندی کرد. مطالعات مبتنی بر برچسب‌گذاری ایزوتوپ و رویکردهای مبتنی بر سینتیک، محدود به شبکه‌های متابولیک پایه  یا آنالیز سلول کامل  هستند. درحال حاضر هیچ‌یک از این روش‌ها توانایی مطالعه در مقیاس ژنوم را ندارد و همچنین بخش‌بندی اختصاصی اندامک‌های ارگانیسم را در نظر نمی‌گیرد.

امروزه روش‌های مدلسازی مبتنی بر محدودیت به‌طور گسترده در مدلسازی متابولیکی مورد استفاده قرار می‌گیرد. این مدل‌ها درک عمیق از میکروارگانیسم‌ها و متابولیسم آن‌ها را با شبیه‌سازی جریان درون‌سلولی را در سرتاسر یک شبکه متابولیک مقیاس ژنوم، ممکن می‌سازند.

مدل‌های متابولیکی مقیاس ژنوم، یک نمایش ریاضی از تمام اطلاعات بیوشیمیایی و ژنومی موجود در یک ارگانیسم خاص است. این مدل‌ها به‌طور گسترده در طراحی‌های مهندسی از طریق بهینه‌سازی فرایندهای بیوشیمیایی در یک ارگانیسم مورد استفاده قرار گرفته‌اند. بازسازی یک شبکه متابولیک می‌تواند با شناسایی و افزودن واکنش‌های یک به یک انجام گیرد و یا می‌توان با ایجاد یک بازسازی مبتنی بر همولوژی توالی به ارگانیسم‌های مرتبط دیگر آغاز شود. تا سال 2018 حدود 44 مدل متابولیک برای میکروارگانیسم‌های روغنی گزارش شده‌است. جزئیات مربوط به ویژگی‌های مدل‌های موجود در جدول زیر خلاصه شده‌اند.

اولین مدل‌های متابولیکی مقیاس ژنوم برای میکروجلبک برای گونه chlamydomonas reinhardtii و Synechocystis sp. ارائه شد. بازسازی یک مدل متابولیکی مقیاس‌ژنوم نیازمند اطلاعاتی بسیار در زمینه توالی ژنوم، عملکرد ژن‌ها و متابولیسم است. در بیشتر مدل‌های متابولیکی، اصلاح دستی برای بهبود دقت مدل‌ها مورد نیاز است. این فرایند اصلاح بسیار زمان‌بر و فعالیتی متمرکز است که اغلب هفته‌ها تا ماه‌ها طول می‌کشد. برای آسان‌تر شدن ارائه مدل و همچنین تسریع در بازسازی آن، مسیرهای خودکاری مانند ModelSEED و PATRIC در دسترس عموم قرار گرفته‌اند.

این مسیرها ابزارهای بازسازی مبتنی بر حاشیه‌نویسی (annotation) زیرسیستم‌ها هستند. در این روش، شبکه‌های متابولیکی به زیرسیستم‌هایی تجزیه شده و به‌صورت جداگانه تحلیل می‌شوند. هر دو ابزار مذکور مبتنی بر فناوری RAST (حاشیه‌نویسی سریع با استفاده از تکنولوژی زیرسیستم‌ها) هستند که توالی ژنوم را با اطلاعات موجود از میکروارگانیسم‌های مشابه از لحاظ فیلوژنتیکی مقایسه می‌کند. با این حال لازم به ذکر است که بازسازی‌شده ایجاد شده توسط ابزارهای خودکار معمولاً دارای خطا بوده و در مرحله بعد محققان توجه ویژه‌ای به کنترل کیفیت مدل و همچنین تضمین کیفیت آن (QC و QA) دارند. یکی از اشتباهات شایع در بازسازی این مدل‌ها عدم موازنه جرم و همچنین تولید انرژی بدون ورودی است که باید به‌صورت دستی مورد اصلاح قرار گیرد.

بنابراین مدل‌های بازسازی‌شده خودکار و نیمه‌خودکار نیاز به اصلاح دستی (manual curation) دارند که توانایی پیش‌بینی‌های دقیق و جزئی را داشته باشند. شکل زیر روند تاریخی مدل‌های پایه‌ای و مقیاس ژنوم که برای میکروجلبک‌ها تا به امروز گزارش شده‌است را نشان می‌دهد.

همه مدل‌های متابولیکی مقیاس ژنوم را می‌توان به زبان یک موازنه جرم کلی بیان کرد. این موازنه جرم شامل همه متابولیت‌های تولید یا مصرف‌شده در واکنش مربوطه می‌شود. این موازنه جرم در معادله زیر نشان داده می‌شود:

در این معادله، C نشان‌دهنده غلظت لحظه‌ای متابولیت‌ها درون سلول، عبارت v  شامل نرخ تمام واکنش‌ها و ماتریس [S] نشان‌دهنده اطلاعات استوکیومتری در مورد واکنش‌ها و متابولیت‌های شرکت‌کننده است. ماتریس استوکیومتری یک نیاز مشترک بین تمام روش‌های تحلیل شار مبتنی بر محدودیت است. هر ستون از این ماتریس شامل ضرایب استوکیومتری یک ترکیب برای تمامی واکنش‌ها است. به‌عبارت دیگر، هر سطر نشان‌دهنده ضرایب تمام متابولیت‌هایی است که در یک واکنش واحد شرکت می‌کنند.

ماتریس S با ابعاد m (تعداد متابولیت‌ها) در n (تعداد واکنش‌ها) است که در آن همیشه تعداد n بزرگتر از m است. ​ماهیت مستطیلی ماتریس S یکی از مهم‌ترین موانع جهت یافتن پاسخ صحیح در شرایط بررسی شبکه‌های متابولیک است. همانگونه که دیده می‌شود برای m تعداد از متابولیت‌ها، m نرخ تغییر در بردار C (غلظت لحظه‌ای متابولیت‌ها)، تعداد m نرخ انتقالی (transport) و p نرخ درون سلولی وجود دارد که ناشناخته هستند. در نتیجه سیستم معادلات این مسئله شامل تنها m موازنه جرم و تعداد n=2m+p متغیر است. این سیستم نامعین، چیزی است که سبب شده است چندین رویکرد متفاوت در حل مدلسازی متابولیکی ارائه شود که در ادامه مورد بحث و بررسی قرار می‌گیرند.

برای معین‌کردن این سیستم نیاز است که کل m-n متغیر محاسبه شود. این تعداد متغیر که اصطلاحاً درجه آزادی نامیده می‌شود، در برخی شبکه‌های متابولیکی بزرگ به بیش از 100 نیز می‌رسد که به همین دلیل، مدل‌های پایه‌ای، با تمرکز بر متابولیسم مرکزی، توسعه یافته‌اند. این مدل‌ها در برخی آنالیز‌های شار متابولیک مانند آنالیز کربن 13- MFA استفاده می‌شوند. با این حال، در حال حاضر استفاده از شبکه‌های متابولیک بزرگ و بخش‌بندی‌شده برای تحلیل فلاکسومیک از نظر محاسباتی غیرعملی است. از همین رو، مهندسان متابولیک این چالش را با ایجاد تغییراتی در معادله (1) یعنی تبدیل معادله به یک مسئله بهینه‌سازی با استفاده از یک تابع هدف و یک مجموعه تعریف‌شده از محدودیت‌ها برطرف کردند. تعریف محدودیت‌ها منجر به ایجاد یک فضای راه‌حل می‌شود، که تمام حالت‌های عملکردی ممکن یک شبکه بازسازی‌شده و مجموعه تنظیمات مجاز فنوتیپ را در نظر می‌گیرد. مدل‌های متابولیک عمدتاً سه نوع محدودیت را در نظر می‌گیرند: (1) محدودیت‌های فیزیکی-شیمیایی که مبتنی بر قوانین بقای جرم و انرژی، وابسته بر نرخ واکنش‌های بیوشیمیایی و ترمودینامیک هستند؛ (2) محدودیت‌های محیطی، مانند در دسترس بودن مواد مغذی، گیرنده‌های الکترونی و دیگر شرایط خارجی (مانند جذب فوتون) و (3) محدودیت‌های تنظیمی، از جمله ترکیب آنزیمی و عملکردی، که به کاهش اطلاعات مربوط به ژن، مانند داده‌های بیان و ارتباط های ژن- پروتئین- واکنش، کمک می‌کند.​

در میکروارگانیسم‌های فوتوتروفی، برخی از محدودیت‌های فیزیکی با توجه به محدودیت‌های ترمودینامیکی یعنی جهت و برگشت‌پذیری یا برگشت‌ناپذیری واکنش‌ها که به کمک محاسبه انرژی آزاد گیبس تعیین شود، انتخاب می‌شوند. محدودیت‌های محیطی​ ​معمولاً بر اساس مقادیر تجربی اندازه‌گیری‌شده جذب نور، جذب عناصر غذایی و جذب سوبسترا می‌باشد. برخی از محدودیت‌های تنظیمی نیز در مطالعه توسط levering و همکاران استفاده شده است، که در آن یک مدل متابولیک مقیاس ژنوم، برای ثبت واکنش در شرایط مختلف محیطی ناشی از یک شبکه تنظیمی نسخه‌برداری مورد استفاده قرار گرفت. با وجود این، هنوز متغیرهای زیادی وجود دارند که باید در سیستم‌های دینامیکی حساب شوند.

بررسی و آنالیز شبکه‌های متابولیک

روش‌های مختلفی برای تحلیل شبکه متابولیک میکروجلبک‌ها وجود دارد. در بیشتر مطالعات مدلسازی متابولیکی میکروجلبک های روغنی از FBA برای شبیه‌سازی استفاده می‌شود. برخی از روش‌های دیگر مانند کربن 13-MFA  یا EM به‌عنوان جایگزین یا مکمل این روش مورد استفاده قرار گرفته‌اند. ‏شکل زیر مدل‌ها و روش‌های مورد استفاده در مطالعات 44 گانه تا سال 2018 را نشان می‌دهد. در حال حاضر، شبکه‌های متابولیک بزرگ مقیاس به‌طور عمده دورن‌رایانه‌ای و با استفاده از روش FBA تحلیل می‌شوند. تحلیل داده‌های دینامیک به‌دست‌آمده توسط راهبردهای متمرکز تجربی -مانند کربن 13-MFA- بر مدل‌های متابولیک ساده شده -مانند نمایش متابولیسم مرکزی- متکی است. همانگونه که ‏شکل زیر نشان می‌دهد، در آنالیز شبکه‌های متابولیک میکروجلبک‌ها بیشتر از روش FBA استفاده شده است.

 آنالیز موازنه شار (FBA)

روش FBA به کاربرد برنامه‌نویسی خطی برای آنالیز شارها، تحت شرایط موازنه متابولیتی اشاره دارد. این عبارت بر اساس دو فرض استوار است: اول، سلول‌ها در حالت پایدار هستند و دوم، همه سلول‌ها در حال رشد یک هدف کلی دارند. فرض اول، سیستم را با نادیده گرفتن تمام رفتار گذرای غلظت متابولیت، به‌طور قابل‌توجهی ساده می‌کند، در نتیجه معادله زیر را حاصل می‌کند.

حذف همه نرخ‌های تغییر غلظت مجهول در داخل به لحاظ ریاضی مناسب است، اما روی سیستم فشار می‌آورد، یعنی یک فلاسک کشت و یا بیوراکتور به لحاظ نظری در حالت پایدار وجود داشته باشد.

فرض دوم تابع هدف در مدل نشان می‌دهد که همه سلول‌ها با یک هدف خاص رشد می‌کنند، که برای هر سلول در طول زمان محاسبه، یکسان است. گسترده‌ترین تابع هدف برای FBA، “بیشینه کردن تولید زیست‌توده” است، که دلالت بر این دارد که ارگانیسم به اندازه کافی رشد کرده تا آرایش بهینه شار داشته باشد تا رشد آن به حداکثر برسد.

در حالی که این فرض ممکن است برای برخی از میکروارگانیسم‌ها درست باشد، اما به‌طور کلی صحیح نیست. به‌عنوان مثال، در شرایط کمبود مواد مغذی، هدف سلول ممکن است تولید زیست‌توده نباشد، بلکه بهینه‌سازی نرخ تولید ترکیبات ذخیره‌ای برای استفاده بعدی است. به روشی مشابه، ما می‌دانیم که حالت‌های فنوتیپی طبق شرایط رشد یا شرایط محیطی، به‌ویژه آن‌هایی که ترکیب زیست‌توده دینامیک دارند، مانند فتوتروف‌ها و مخمرها، متفاوت است. مثلاً در ‏شکل (2-4) تغییرات ساختار زیست‌توده برای Chlorella vulgaris در مقدارهای مختلف نیتروژن و طول زمان نشان داده شده است.

بنابراین با در نظر گرفتن ظرفیت نگهداری در طول دوره‌های تاریکی، ترکیبات زیست‌توده ویژه برای چرخه‌های نور-تاریکی مورد نیاز است. این موضوع مورد مناسبی برای تولید مواد اولیه سوخت‌زیستی است. علاوه بر این، ماکزیمم‌سازی نرخ جذب کربن به‌عنوان یک تابع هدف مناسب برای مدل‌سازی‌های آتوتروفی در طول دوره نوری ارائه شده‌ است. مفید بودن روش FBA در مطالعات مختلفی ثابت شده‌ است و اگرچه یک حالت پایدار واقعی به‌ندرت در محیط‌های آزمایشی دیده می‌شودف اما این روش برای نشان دادن رفتار آزمایشگاهی کلی به‌صورت درون‌رایانه‌ای مفید است. تطبیق‌پذیری آن و تکرارپذیری دقیق نتایج تجربی تحت شرایط محیط کشت مختلف، FBA را به یکی از پرکاربردترین روش‌های مدل‌سازی متابولیک تبدیل کرده است.

تابع هدف زیست‌توده

تابع هدف زیست‌توده یک تابع هدف پراستفاده است، که منابع مکمل را در سراسر شبکه متابولیک ایجاد می‌کند تا همه اجزای سلولی شناخته‌شده در مدل مانند اسیدهای آمینه، نوکلئوتیدها، اسیدهای چرب، کربوهیدرات‌ها، ویتامین‌ها، یون‌ها، و کوفاکتورها را تولید کند. ماکزیمم کردن BOF امکان شبیه‌سازی نرخ رشد و بازده منبع کربن به زیست‌توده را امکان پذیر می‌سازد. BOF را می‌توان از توالی ژنوم یا از طریق آزمایش تعیین کرد. هر دو روش به خصوص برای میکروارگانیسم‌های پروکاریوتی به طور موفقیت آمیزی به‌کار گرفته شده‌اند.

هنگامی‌که میکروارگانیسم‌ها در معرض شرایط غیر بهینه دما، پی‌هاش و یا غلظت مواد مغذی محدود قرار می‌گیرند، اغلب تنها یک BOF برای پیش‌بینی موفقیت داده‌های تجربی مناسب نیست. برای این موارد، توابع هدف کمکی، مانند حداقل کردن تولید ATP، نرخ جذب سوبسترا یا نرخ تولید پتانسیل احیایی ضروری هستند.

تابع هدف زیست‌توده به‌طور کلی شامل تعریف مجموعه‌ای از متابولیت‌ها است که زیست‌توده را تشکیل می‌دهند. مجموعه متابولیت‌ها را می‌توان تنها یک واکنش در نظر گرفت که یک ترکیب فرضی به نام “زیست‌توده” تولید می‌کند، یا در غیر این صورت می‌توان مجموعه واکنش‌هایی برای ساخت اجزای زیست‌توده (کربوهیدرات، لیپیدها، پروتیین‌ها، DNA، RNA، رنگدانه‌ها و غیره) تشکیل داد.

تابع هدف زیست‌توده مدل‌های متابولیک دستی‌اصلاح‌شده از میکروارگانیسم‌های روغنی، اغلب صدها متابولیت را به‌عنوان بخشی از متابولیسم لیپیدها گزارش می‌دهد، زیرا در این موجودات، لیپیدها هدف اصلی تولید سوخت‌های زیستی هستند. اسیدهای چرب زنجیره لیپید (14:0، 16:1، 18:1، 16:2) معمولا به‌صورت (triacyglycerols (TAG یا  (monogalactosyldiacylglycerols (MGDG و غیره خلاصه می‌شوند که نمایان‌گر کلیه لیپیدهای موجود در ارگانیسم است.

ترکیب دقیق BOF پیش‌بینی بهبود حالت‌های فنوتیپی را ممکن ساخته‌است. ادعا شده‌ است که BOF اجباری، به پیش‌بینی شرایط آزمایشگاهی مواد مغذی و شرایط نوری محدود نیز کمک می‌کند. در برخی موارد، تابع هدف زیست‌توده با یک روش بهینه‌سازی دو مرحله‌ای با حداقل‌سازی نرخ جذب، کامل شده‌ است. در شرایط رشد آتوتروف، به حداقل رساندن جذب نور (فوتون‌ها) به‌کار گرفته شده‌ است، اما بهبود قابل‌توجهی در پیش‌بینی نرخ رشد به‌دست نیامده است. به همین ترتیب، حداقل‌سازی نرخ جذب سوبسترای منبع کربن برای رشد هتروتروفی مورد استفاده قرار گرفته‌ است. به‌عنوان جایگزین و مکمل تابع هدف زیست‌توده، به حداقل رساندن مقادیر شار در سراسر شبکه برای p. tricornutum، افزایش بازده ATP و به حداقل رساندن تقاضای ATP برای C. reinhardtii و حداکثر کردن نرخ تولید هیدروژن برای C. reinhardtii و Synechocystis sp مورد استفاده قرار گرفته است.

آنالیز موازنه شار دینامیکی (dFBA)

غلبه بر فرض حالت پایا FBA استاندارد برای مدل‌سازی سیستم‌های بسیار دینامیک (مشخصه میکروارگانیسم‌های فتوسنتزی) بسیار ضروری است. این ارگانیسم‌ها تحت شرایط چرخه نور/ تاریکی تکامل یافته‌اند که نیاز به تغییر بین حالت‌های مختلف فنوتیپی دارند. در طول دوره‌های نوری، کربن آلی به ذخیره ترکیبات کربن، مانند کربوهیدرات‌ها و چربی‌ها تبدیل می‌شود که در دوره تاریکی مصرف می‌شوند تا عملکرد سلول‌های حیاتی را همساز کند. رفتار “ذخیره برای بعد” منجر به یک ترکیب زیست‌توده دینامیک می‌شود که می‌تواند در طول دوره نوری (ساعت‌ها) یا در طول دوره رشد (روزها) تغییر کند. در مورد C.vulgaris و دیگر فتوتروف‌ها، نشان‌داده شده‌ است که ترکیب زیست‌توده نیز به در دسترس بودن نیتروژن وابسته است. از آنجا که FBA تحت یک فرض حالت پایدار مورد استفاده قرار می‌گیرد، عملاً استفاده از آن در موارد فوق‌الذکر غیرممکن می‌شود. از طرف دیگر، صدق نکردن این فرض، مجموعه‌ای از معادلات دیفرانسیل معمولی را به مسئله اضافه می‌کند و یک سیستم دیفرانسیلی-جبری ایجاد می‌کند. برای حل این مسئله، رویکرد FBA دینامیک با استفاده از یک رویکرد بهینه‌سازی دینامیک یا یک رویکرد بهینه‌سازی استاتیک پیشنهاد شده‌ است.

رویکرد بهینه‌سازی دینامیک (DOA) پروفایل‌های زمانی جریان و غلظت متابولیت را با حل مسئله بهینه‌سازی در کل بازه زمانی مورد نظر محاسبه می‌کند و تنها یک‌بار محاسبات را انجام می‌دهد. سیستم دینامیکی با پارامتر کردن معادلات دیفرانسیل با استفاده از روش جمع متعامد روی عناصر محدود به یک مسئله برنامه‌ریزی غیرخطی  تبدیل می‌شود. سپس BOF به‌صورت میانگین وزنی توابع هدف لحظه‌ای و پایانی بازنویسی می‌شود و در معرض سیستم معادلات دیفرانسیل و به همراه قیدهای آن قرار می‌گیرد. از طرف دیگر، رویکرد بهینه‌سازی استاتیک SOA، مساله بهینه‌سازی را چندین بار، هربار برای یک بازه زمانی، حل می‌کند. در پایان، مجموعه‌ای از مقادیر تغییر لحظه‌ای در بازه زمانی برای محاسبه غلظت متابولیت‌ها انجام می‌شود.

قیدهای BOF مبتنی بر آزمایش، یک روش جایگزین برای شبیه‌سازی رفتار متابولیک دینامیک هستند. تغییرات در BOF بر وضعیت شبکه متابولیک و در نتیجه به‌طور مستقیم بر پیش‌بینی‌ها تأثیر می‌گذارد. این روش دقت پیش‌بینی شار با در نظر گرفتن اندازه‌گیری‌ها را در طول دوره رشد تحت آتوتروفی و هتروتروفی در chlorella vulgaris افزایش داده است. توزیع شار سری زمانی به‌درستی ۷۵ درصد از داده‌های بیان و پروتئومیکس که در طول دوره رشد جمع‌آوری می‌شوند شامل آنزیم‌های واکنش‌های آلوستریک و چندگانه زیرواحد را شبیه‌سازی می‌کند. این روش همچنین تعیین مقدار خالص ذخیره‎‌های نیتروژنی در هر شرایط را ممکن کرد.

آنالیز موازنه شار ناپایا

هنگامی‌که تعیین تجربی متابولیت‌های تشکیل‌دهنده BOF امکان‌پذیر نیست، روش‌های غیر پایا مانند آنالیز موازنه شار غیرپایا (uFBA) را در مدل‌سازی متابولیکی میکروجلبک می‌توان به کار برد. این روش‌های غیر پایا با تعداد محدودی متابولیت‌های اندازه‌گیری شده عمل می‌کنند. روش uFBA اخیراً توسعه‌ یافته و برای مطالعه میکروارگانیسم‌های هتروتروف به کار گرفته شده‌ است، اما uFBA یک روش امیدوارکننده برای تجزیه و تحلیل میکروارگانیسم‌های فتوسنتزی خواهد بود.

هدف uFBA محاسبه توزیع شار داخلی از داده‌های دوره زمانی موجود مثل داده‌های متابولومیکس هدف است. این مجموعه داده‌ها معمولاً شامل اطلاعاتی در مورد چندین (۵ تا ۱۰) متابولیت مانند گلیسرول، اتانول و استات است. لازم است که میزان تغییر این متابولیت‌ها را از داده‌های تجربی تعیین کنیم و این نرخ‌ها را در سیستم معادلات قرار دهیم. به‌صورت ایده‌آل، تمام نرخ‌های تغییر شناخته‌شده و uFBA می‌تواند به‌عنوان یک سری از روش‌های استاندارد FBA اجرا شود. از آنجایی که این امر اغلب امکان‌پذیر نیست، فرض می‌شود که تمامی‌متغیرهای غیرقابل اندازه‌گیری در ابتدا تحت شرایط حالت پایدار و یک سیستم بسته یعنی بدون هیچ انتقال درون یا خارج سلولی هستند. حذف این مقدار از واکنش‌های انتقال اغلب می‌تواند مدل‌سازی سیستم را تضعیف کند، به‌همین دلیل سیستم نیاز به بهبود بیشتر دارد. الگوریتم “شل‌کردن گره متابولیت” به‌کار گرفته شده‌ است که واکنش‌های سینک را به متغیرهای اندازه‌گیری‌نشده نسبت دهد تا تجمع و یا تخلیه آن‌ها را امکان‌پذیر سازد. این الگوریتم مبتنی بر بهینه‌سازی‌هایی است که حداقل تعداد واکنش‌های سینک را در شرایطی که مدل محاسبه‌پذیر نگه‌داشته می‌شود، پیدا می‌کند.

آنالیز شار متابولیک

روش MFA جایگزینی برای FBA است که یک موازنه جرم پایدار را نیز در نظر می‌گیرد. هنگام کار با شبکه‌های متابولیک کوچک، می‌توان تعداد کافی از شارهای داخلی یا خارجی را برای تعیین سیستم معادلات جبری تعیین یا تعریف کرد. برای این راهبرد، معادله زیر با تجزیه ماتریس و بردار به شار قابل‌اندازه‌گیری (شناخته‌شده) و غیرقابل اندازه‌گیری (ناشناخته) بازنویسی می‌شود.

هرچه شبکه متابولیک بزرگ‌تر باشد، شار بیشتری برای اندازه‌گیری سیستم لازم است. بنابراین، شبکه‌های متابولیک با صدها واکنش، نیازمند اندازه‌گیری شارهای داخلی برای بیشتر شارها، مثلاً به کمک برچسب گذاری کربن 13 هستند.

حالت‌های پایه

روش EM مبتنی بر محاسبه همه راه‌حل‌های سیستم در رابطه [S].v=0 در فضای شار مجاز است، که راه‌حل را با یک محدودیت ترمودینامیکی و یک محدودیت غیرقابل حل شدن، محدود می‌کند. محدودیت غیرقابل حل شدن هر راه‌حل را یک حالت شار اولیه  می‌سازد، که به این معنی است که آن یک مجموعه منحصر به فرد و حداقلی از مجموعه واکنش‌ها است. این مجموعه‌ها را می‌توان به واکنش‌های ماکروسکوپی بازنویسی کرد، در نتیجه درجات آزادی که قبلاً در معادله بالا نشان داده شد را کاهش می‌دهد. اغلب، EM با مدل‌های متابولیک با مقیاس ژنوم مرکزی  ترکیب می‌شود تا کارآیی انرژی و توزیع شار بهینه را فراهم کند. استفاده از آنالیز EM در طی سال‌های گذشته کاهش یافته است، که بخشی از آن به‌دلیل توسعه سریع ابزارهای امیک مورد استفاده در توالی‌یابی است، که امکان بازسازی شبکه متابولیک مقیاس ژنوم را بر اساس توالی‌یابی کامل ژنوم فراهم می کند.​