بیوتکنولوژی کشاورزی

تاریخچه تکنولوژی RNAi

مقدمه ای بر RNAi

RNAهای کوچک غیر کدشونده، توالی‌هایی با طول 20-25 نوکلئوتید هستند که طی فرایندی که با عنوان تداخل آر ان ای (RNA interference, RNAi) یا خاموش‌سازی توسط آر ان ای (RNA silencing) شناخته می‌شود کارکردهای متنوعی در تنظیم بیان ژن، نمو، تنظیم ساختار کروماتین و پاسخ‌های دفاعی در برابر ویروس‌ها و ترنسپوزون‌ها ایفا می‌کنند [1].

این مکانیسم که طی دهه‌های اخیر به طور گسترده در گیاهان و حیوانات مورد مطالعه قرار گرفته است اولین بار به طور اتفاقی در حین انتقال یک تراژن به گیاهان مشاهده گردید، هر چند که پی بردن به علت اصلی رخداد آن تا اواخر قرن بیستم به طول انجامید. امروزه القای RNAi با استفاده از RNAهای دو رشته‌ای بلند Double-stranded RNA, dsRNA)، RNA) سنجاق سری کوتاه (Short hairpin RNA, hpRNA) و RNA تداخلی کوچک (Short interfering RNA, siRNA) به ابزاری استاندارد جهت بررسی کارکرد ژن بدل شده است[2].

کاربرد این تکنیک در کشاورزی نیز بدون توجه باقی نمانده و از آن به عنوان راهکاری امید بخش جهت مبارزه با آفات و بیماری‌های گیاهی و هم‌چنین بهبود صفات گیاهی یاد می‌شود [3]. در این مطلب سعی خواهیم کرد به طور خلاصه به وقایعی که منجر به کشف این پدیده شده است اشاره کنیم.

اولین مشاهدات

همان‌طور که اشاره شد، اولین مواجهه با این پدیده در گیاهان و به طور اتفاقی صورت گرفت. در سال 1990 میلادی، ناپولی (Napoli) و یورگنسن (Jorgensen) که در کمپانی آمریکایی DNA Plant Technology Corporation، روی رنگ گل اطلسی کار می‌کردند، نتایج مطالعه خود را در نشریه The Plant Cell منتشر کردند.

این محققین به دنبال آن بودند که بدانند آیا آنزیم چالکون سینتاز (chalcone synthase, CHS) که آنزیمی حیاتی در بیوسنتز فلاونوئید است، نقش محدودکنندگی در نرخ بیوسنتز آنتوسیانین دارد یا نه؛ چرا که مسیر بیوسنتزی آنتوسیانین مسئول ایجاد رنگ بنفش در اطلسی است. انتظار می‌رفت که گیاهان تراریخت شده با ژن CHS بتوانند بیش بیان رنگ داشته باشند اما نتیجه متفاوتی مشاهده شد. تمامی گیاهان تراریخت به دست آمده، سفید رنگ و یا کم رنگ‌تر از گیاهان تیپ وحشی بودند.

میزان بیان ژن CHS در گیاهان تراریخت 50 برابر کم‌تر از گیاهان تیپ وحشی بود. در عمل، ژن انتقال یافته منجر به توقف مسیر بیوسنتزی آنتوسیانین شده بود. به همین دلیل این محققین این‌گونه نتیجه‌گیری کردند که تراژن مورد نظر منجر به بازدارندگی بیان ژن CHS شده است و از این رو این پدیده را سرکوب‌گری مشترک (co-suppression) نامیدند [4,5].

بد نیست اشاره شود که تا قبل از این اتفاق، نقش RNAی آنتی‌سنس در جلوگیری از بیان ژن از طریق اتصال به رشته mRNA مشخص شده بود و هم‌چنین اتصال دو رشته سنس و آنتی‌سنس RNA و تشکیل dsRNA نیز در برخی آزمایش‌ها مشاهده گردیده بود [6].

در مطالعه دیگری در سال 1992، رومانو (Romano) و ماچینو (Macino) در دانشگاه ساپینزای (Sapienza) رُم ایتالیا با نتایج مشابهی روی کپک  Neurospora crassa مواجه می‌شوند. آن‌ها مشاهده می‌کنند که وارد کردن بخش‌هایی از ژن‌های al-3 و al-1 به صورت خارجی به کپک، می‌تواند منجر به جلوگیری از بیان ژن‌های داخلی متناظر شود.

این محققین این پدیده را فرونشانی (quelling) نامیده و اشاره می‌کنند که این پدیده قابلیت برگشت‌پذیری به صورت خود به خودی دارد. آن‌ها هم‌چنین علت احتمالی این پدیده را تداخل بین ژن‌های داخلی و خارجی بیان کرده و با اشاره به نتایج ناپولی اظهار می‌دارند که احتمالاً گیاهان و قارچ‌ها توانایی جست‌وجو و تغییر توالی‌های دو برابر شده‌ی درج شده در ژنوم را دارا می‌باشند [7].

لیندبو (Lindbo) و همکارانش در در دانشگاه ایالتی اورگان آمریکا طی آزمایش‌هایی دریافتند که به منظور ایجاد مقاومت القاء شده توسط پاتوژن (pathogen-derived resistance, PDR)، وجود RNAی ویروسی کفایت می‌کند و نیازی به بیان پروتئین‌های پاتوژن نیست. از آن‌جایی‌که ایجاد مقاومت با کاهش mRNA ژن ویروسی در بافت‌های هدف همبستگی داشت، این محققین احتمال دادند که این پدیده مشابه با پدیده سرکوب‌گری مشترک باشد [8,9]. آن‌ها بیان می‌دارند که علت مقاومت می‌تواند به دلیل اتصال RNAی ویروسی درج شده در گیاه با RNAی ویروس باشد که خود به نحوی از فعالیت آنزیم رپلیکاز در ساخت رشته مقابل RNA ویروسی جلوگیری می‌کند [8].

در سال 1995 گو (Guo) و کمفیوس (Kemphues) از دانشگاه کورنل، در حین وارد کردن رشته‌های RNA سنس و آنتی‌سنس ژن par-1 به نماتد Caenorhabditis elegans متوجه تخریب mRNA ژن par-1 شدند. در این زمان استفاده از RNA آنتی‌سنس یکی از روش‌های مرسوم جهت توقف بیان ژن بود. زیرا تصور بر این بود که RNA آنتی‌سنس به mRNA هدف متصل شده و با ایجاد dsRNA از بیان ژن و ترجمه جلوگیری کرده و یا توسط نوکلئازهای سلول تخریب می‌شود. این محققین زمانی که رشته سنس ژن par-1 را به درون سلول وارد کردند، علی رغم انتظارشان، ژن مورد نظر باز هم خاموش شد [5,10].

کشف عامل خاموشی

شاید بد نباشد به نقش پروفسور دیوید بلکمب (David Baulcombe) انگلیسی در کشف ماهیت این پدیده نیز اشاره کنیم. پروفسور بلکمب که هم اکنون استاد گیاهشناسی دانشگاه کمبریج است، در آن زمان به تازگی به عنوان محقق به موسسه تحقیقاتی The Sainsbury Laboratory ملحق شده بود و بر روی ارتباط پاتوژن‌های ویروسی و مقاومت گیاه فعالیت می‌کرد. مطالعات پیوسته این محقق به همراه گروه تحقیقاتی‌اش در طی چند سال نتایجی را به دنبال داشت که بی تردید در کشف پدیده RNAi حائز اهمیت است [11-13].

David Baulcombe
David Baulcombe

در 1996، انگلیش (English) و بلکمب با تراریخت کردن گیاه سیب‌زمینی با سازه دارای ژن GUS مشاهده کردند که ژن خاموش شده‌ی GUS می‌تواند از ایجاد بیماری توسط ویروس سیب‌زمینی ایکس (X potato virus)، جلوگیری کند. در 1999، همیلتون (Hamilton) و بلکمب مقاله دیگری را در نشریه Science منتشر کردند. آن‌ها مشاهده کردند که گیاهان دارای تراژنِ خاموش شده حاوی مقادیری از انواع RNAهای دو رشته‌ای هستند که توالی آن‌ها مشابه با تراژن خاموش شده است [12]. آن‌ها دریافتند که چنین RNAهای کوتاه 25 نوکلئوتیدی در حین آلودگی گیاه به PVX نیز مشاهده می‌شود و به همین دلیل احتمال دادند که این RNAهای کوچک در مقاومت ضد ویروسی گیاه نقش داشته باشند [13].

بلکمب و گروه‌اش در مقاله دیگری که در Science منتشر می‌کنند اظهار می‌دارند که مکانیسم خاموش‌سازی ژن در گیاهان بسیار شبیه به آن چیزی است که در مقاومت به ویروس‌ها رخ می‌دهد و این احتمال را می‌دهند که پدیده خاموشی ژن ناشی از مکانیسم طبیعی دفاع ویروسی گیاه باشد [14]. می‌توان گفت که بلکمب با تحقیقاتش نقش به‌سزایی در مشخص کردن نقش dsRNA به عنوان عامل خاموشی داشته است.

در نهایت در سال 1998، اندرو فایر (Andrew Fire) و کرگ ملو (Craig Mello) به همراه گروه تحقیقاتی‌اش از آمریکا مقاله‌ای را در نشریه Nature منتشر می‌کنند که محتوای آن شرح‌دهنده تمامی پدیده‌های مشاهده شده است. این محققین بر اساس نتیجه‌ی گو و کمفیوس در خاموش شدن ژن توسط رشته سنس، فرضیه خود را اینگونه بیان کردند که عامل پدیده خاموشی احتمالاً dsRNA است نه ssRNA و احتمال دادند که در جداسازی رشته سنس توسط گو و کمفیوس، dsRNA به طور کامل حذف نشده است.

به منظور بررسی این فرضیه این محققین ssRNAهای سنس و آنتی‌سنس ژن unc-22 را با دقت بسیار بالا خالص‌سازی کرده و اثر آن‌ها در خاموش‌سازی را با dsRNA مربوطه مقایسه کردند. رشته‌های ssRNA خالص‌سازی شده در مقایسه با dsRNA حدود 10 تا 100 برابر تأثیر کم‌تری در خاموش‌سازی داشتند. کاربرد رشته سنس زمانی می‌توانست به طور موثر منجر به خاموش‌سازی شود که رشته آنتی‌سنس به آن اضافه شود و برعکس، رشته آنتی‌سنس زمانی می‌توانست در خاموش‌سازی موثر واقع شود که رشته سنس اضافه شود که این امر خود نشان‌دهنده اتصال رشته‌های سنس و آنتی‌سنس به هم و تشکیل dsRNA است [15].

بدین ترتیب عامل پدیده خاموشی مشخص گردید اما مکانیسم عمل آن ناشناخته باقی ماند. خوب است به این نکته اشاره شود که فایر و ملو به خاطر این کشف جایزه نوبل سال 2006 را در بخش فیزیولوژی و پزشکی دریافت کردند؛ جایزه‌ای که به ندرت به کشفیاتی با قدمت کم‌تر از ده سال تعلق گرفته است.

Craig Mello (Left) and Andrew Fire (Right)
Craig Mello (Left) and Andrew Fire (Right)

در سال 2000 دو گروه مستقل از هم دریافتند که dsRNA خود در عمل به siRNAهایی با طول 21 تا 23 نوکلئوتید تبدیل می‌شود که عامل القای RNAi است.

منابع مقاله RNAi

1- Lindbo, J. A. & Dougherty, W. G. Plant pathology and RNAi: a brief history. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 191-204 (2005).
2- Bucher, E. & Prins, M. in Natural resistance mechanisms of plants to viruses     45-72 (Springer, 2006).
3- Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G. & Christiaens, O. RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: what we know so far. Frontiers in physiology 7, 553 (2016).
4- Napoli, C., Lemieux, C. & Jorgensen, R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. The plant cell 2, 279-289 (1990).
5- Sen, G. L. & Blau, H. M. A brief history of RNAi: the silence of the genes. The FASEB journal 20, 1293-1299 (2006).
6- Setten, R. L., Rossi, J. J. & Han, S.-p. The current state and future directions of RNAi-based therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery 18, 421-446 (2019).
7- Romano, N. & Macino, G. Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Molecular microbiology 6, 3343-3353 (1992).
8- Lindbo, J. A. & Dougherty, W. G. Untranslatable transcripts of the tobacco etch virus coat protein gene sequence can interfere with tobacco etch virus replication in transgenic plants and protoplasts. Virology 189, 725-733 (1992).
9- Lindbo, J. A., Silva-Rosales, L., Proebsting, W. M. & Dougherty, W. G. Induction of a highly specific antiviral state in transgenic plants: implications for regulation of gene expression and virus resistance. The Plant Cell 5, 1749-1759 (1993).
10- Guo, S. & Kemphues, K. J. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell 81, 611-620 (1995).
11- English, J. J., Mueller, E. & Baulcombe, D. C. Suppression of virus accumulation in transgenic plants exhibiting silencing of nuclear genes. The Plant Cell 8, 179-188 (1996).
12- Hamilton, A. J. & Baulcombe, D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science 286, 950-952 (1999).
13- Ratcliff, F. G., MacFarlane, S. A. & Baulcombe, D. C. Gene silencing without DNA: RNA-mediated cross-protection between viruses. The Plant Cell 11, 1207-1215 (1999).
14- Ratcliff, F., Harrison, B. D. & Baulcombe, D. C. A similarity between viral defense and gene silencing in plants. Science 276, 1558-1560 (1997).
15- Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. nature 391, 806-811 (1998).

برچسب‌ها
نمایش بیشتر

نوشته‌های مشابه

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

یـک + یـک =

دکمه بازگشت به بالا
EnglishIran
بستن
بستن