تکنیک ها و کاربردهای توالی یابی

آخرین بروزرسانی: 9 فروردین 1398
شما اینجا هستید:
میانگین زمان مطالعه: 20 دقیقه

مقدمه‌ای بر توالی یابی

امروزه تعیین توالی DNA به یکی از مهم‌ترین تکنیک‌های موجود در زمینه زیست شناسی مولکولی تبدیل شده است. در این روش می‌توان ترتیب قرار گرفتن نوکلئوتیدها را در یک قطعه از DNA مشخص نمود. توالی‌یابی ممکن است برای تعیین توالی ژن‌های خاص، مناطق بزرگ ژنومی، کل کروموزوم و کل ژنوم به کار برده شود. امروزه توالی‌یابی DNA یک روش آزمایشگاهی است. روش‌های سنتی توالی‌ یابی که زمان‌بر و گران هستند و دیگر پاسخگوی تحقیقات گسترده دانشمندان نیستند. درنتیجه تکنولوژی‌های عملکردی بالا برای تولید داده یا نسل جدید توالی یابی گسترش یافتند که قادر به توالی‌ یابی هزاران یا میلیون‌ها توالی به صورت همزمان می‌باشند. در نتیجه چندین روش جهت تعیین توالی DNA معرفی شده است. در دهه اخیر تعیین توالی DNA در زمینه پزشکی، کشاورزی، دیگر زمینه‌های علوم زیستی از جایگاه ویژه‌ای برخوردار می‌باشد (۷).

تاریخچه توالی‌ یابی

در سال 1953 واتسون و کریک با کمک اطلاعات کریستالوگرافی ساختار DNA که توسط موریس ویلکینز و روزالین فرانکلین حاصل شده بود، موفق به کشف ساختار سه بعدی DNA شدند. با توجه به طول بلند ملکول DNA و حضور واحدهای ساختاری مشابه، تشخیص توالی آن کار دشواری به نظر می‌آمد و نیازمند توسعه تکنیک‌های جدیدی بود.

اولین تلاش‌ها برای توالی‌یابی بر روی RNAهایی مانند rRNA و tRNA میکروبی و همچنین RNA تک رشته‌ای باکتریوفاژها متمرکز شد. علت استفاده از RNAها این بود که آن‌ها تک رشته‌ای و کوتاه‌تر بودند و به طور کلی پیچیدگی‌های DNA یوکاریوتی را نداشتند. همچنین آنزیم‌های RNase قادر بودند تا زنجیره RNA را در مکان‌هایی که شناخته شده بودند برش دهند. با این وجود پیشرفت در تعیین توالی نوکلئوتیدهای DNA به کندی پیش می‌رفت، زیرا این تکنیک‌ها از آنالیزهای شیمیایی کمک می‌گرفت، و بنابراین قادر به تعیین ترتیب نوکلئوتیدها نبود و تنها ترکیب نوکلئوتیدی را تعیین می‌کرد. هر چند از طریق ترکیب این تکینیک‌ها با تیمارهای ریبونوکلئازهای انتخابی به منظور تولید قطعات RNA، در نهایت در سال 1965 روبرت هالی و همکارانش موفق شدند اولین توالی نوکلئیک اسید مربوط به tRNA آلانین را در مخمر Saccharomyces cerevisiae شناسایی کنند (۱).

همزمان با آن‌ها فردی به نام فرد سنگر و همکارانش تکنیکی مبتنی بر شناسایی قطعات رادیولیبل شده و هضم شده بعد از جداسازی دو بعدی پایه‌ریزی کردند. استفاده از این روش توسط تیم والتر فیرز منجر به تولید اولین توالی یک ژن کد کننده در سال 1972 شد. از آن پس محققان تلاش‌های خود را برای بهبود این روش به کار بردند تا اینکه در سال 1977 پیشرفتی بزرگ برای همیشه تکنولوژی تعیین توالی‌ DNA را تغییر داد و روش خاتمه زنجیره یا دی دئوکسی معرفی شد (۱).

روش تعیین توالی سنگر ابزاری برای رمزگشایی ژنوم فراهم کرد و زیست شناسی را به فضای جدیدی وارد کرد. هدف رمزگشایی ژنوم انسان نیاز به توسعه روش‌های توالی یابی DNA را افزایش داد. به مروز زمان شرکت‌هایی با نام مراکز توالی‌یابی توسعه یافتند و صدها دستگاه توالی یابی DNA را شامل شدند. در سال 2001 حدود 90 درصد ژنوم انسان با استفاده از روش تعیین توالی اتوماتیک سنگر تعیین توالی شد. این روش حدود دو دهه غالب بود.

همزمان با توسعه توالی یابی دی دئوکسی در مقیاس بزرگ، تکنیکی دیگری که تفاوت چشمگیری با تکنیک‌ قبلی داشت ظاهر شد. روش pyrosequencing از جمله روش‌هایی بود که قادر بود قطعاتی با طول 250 نوکلئوتید را تعیین توالی کند اما تعداد قطعات کم توالی‌یابی شده ‌در یک اجرا یکی از مهم‌ترین محدودیت‌های این روش بود. زیرا گذشته از طول قطعات، تعداد قطعات توالی‌ یابی شده در یک اجرا با یک هزینه معین نیز فاکتور مهمی است. با گذشت زمان روش‌های جدیدی با نام نسل بعدی توالی یابی یا NGS برای رفع محدودیت‌های این روش‌ها گسترش یافتند.

نسل جدید تکنیک های توالی یابی ژنتیک

انقلاب در توالی‌یابی در سال 2005 با فناوری توالی‌یابی به‌وسیله سنتز (SBS) و پروتکل مولتی پلکس پلونی ظاهر شد. در این روش‌ برای تهیه الگو ممکن است از یک مولکول DNA منفرد (SMRT, Nonopore) یا از الگوهای تکثیر شده به‌صورت کلون از یک مولکول منفرد (pyrosequencing, SOLEXA, Ion torrent) استفاده شود. فناوری‌های جدید متشکل از استراتژی‌های مختلفی هستند که بر ترکیبی از روش‌های تهیه الگو توالی‌ یابی، تصویربرداری و انطباق توالی و سرهم سازی تکیه دارند. پیشرفت اساسی ایجاد شده به وسیله NGS توانایی تولید حجم بسیار زیادی از داده‌ها با قیمت بسیار ارزان است که امکان جدیدی برای طراحی آزمایش‌های مختلف فراهم کرده است (۴).

این روش‌ها عموماً DNA ژنومی را به صورت تصادفی به اندازه‌های کوچک برش می‌دهند که از آنها قطعات کوتاه (short reads) به دست می‌آید. پس از آنکه قطعات توالی‌یابی شدند با یک توالی مرجع انطباق داده می‌شوند یا اینکه بصورت De novo سرهم سازی می‌شوند. موضوع مشترک در فناوری‌های NGS این است که قطعات به یک سطح جامد متصل یا ثابت شده‌اند. تثبیت الگوها در مکان های جداگانه بر روی سطح اجازه می‌دهد که صدها تا میلیون‌ها واکنش توالی‌یابی بصورت هم‌زمان انجام شود (۴).

امروزه تعیین دقیق ترتیب نوکلئوتیدها در نمونه‌های بیولوژیک به جزء جدایی ناپذیر تحقیقات مختلف تبدیل شده است. ترتیب قرارگیری نوکلئیک اسیدها در زنجیره‌های پلی نوکلئوتیدی اطلاعات مهمی را جهت بررسی ویژگی‌های ارثی و بیوشیمیایی موجود زنده در طول زندگی فراهم می‌کند. بنابراین تعیین ترتیب توالی‌ها برای تحقیقات زیستی ضروری است. در طول سالیان گذشته تلاش‌های گسترده‌ای برای دستیابی به این هدف انجام شده است. به طور کلی روش‌های تعیین توالی DNA به سه نسل اول، دوم و سوم تقسیم بندی می‌شوند که در ادامه به تفکیک توضیح داده می‌شود.

نسل اول توالی‌ یابی

به طور کلی نسل اول توالی‌ یابی‌های DNA به دو روش ختم زنجیره و هضم شیمیایی یا ماکسام-گیلبرت تقسیم بندی می‌شوند. هر دو روش نیازمند ژل پلی آکریل آمید به منظور مرئی سازی قطعات تولید شده و تعیین توالی است.

روش توالی‌ یابی سنگر یا خاتمه زنجیره

مبنای این تکنیک استفاده از آنالوگ‌های شیمیایی نوکلئوتیدی موسوم به ddNTPs یا dideoxynucleotids بود. ddNTPها فاقد گروه OH بر روی کربن ′3 خود برای گسترش زنجیره  DNA هستند و نمی‌توانند با ′5 فسفات dNTP بعدی خود واکنش دهند. بنابراین هنگامی که در زنجیره در حال تکثیر اسید نوکلئیک قرار گیرند واکنش متوقف خواهد شد. ترکیب ddNTPهای رادیولیبل شده همراه با غلظت‌های مشخص از dNTP استاندارد در واکنش سنتز DNA منجر به تولید رشته‌های DNA با طول‌های مختلف می‌شود (تولید رشته‌هایی که تنها در یک نوکلئوتید تفاوت طول دارند). این تکنیک نیازمند DNA تک رشته‌ای به عنوان الگو است که با استفاده از فاژمیدها حاصل می‌شود. DNA تک رشته‌ای به همراه سایر مواد مورد نیاز سنتز DNA به چهار لوله آزمایش که هر کدام حاوی یک نوع باز ddNTP است انتقال داده می‌شود. ddNTPها به طور تصادفی توسط آنزیم DNA پلیمراز به رشته در حال ساخت اضافه می‌شود. نهایتا‌ً در هر لوله آزمایش قطعاتی با طول مختلف تولید می‌شود. قطعات تولید شده بر روی ژل پلی آکریل آمید ران می‌شوند و با استفاده از اتورادیوگراف بر روی ژل ظاهر می‌شوند.

دقت، قدرت و سهولت در روش خاتمه زنجیره یا توالی‌ یا‌بی سنگر باعث شد این تکنیک برای سال‌های متمادی مورد استفاده قرار گیرد. استفاده از نوکلئوتیدهای فلورسنت از جمله پیشرفت‌های اخیر در این روش است که باعث می‌شود به جای چهار لوله آزمایش، واکنش تنها در یک لوله آزمایش انجام شود و هر یک از قطعات DNA با یک رنگ فلوسنت نشانه‌گذاری می‌شود. بنابراین هر قطعه DNA دارای اندازه و رنگ منحصر به فردی خواهد بود. همچنین استفاده از الکتروفورز لوله مویین از دیگر روش‌های توسعه یافته است. دو پیشرفت مذکور به توسعه ماشین‌های توالی‌یابی خودکار کمک کرد (۱،۲،۳).

روش توالی‌یابی ماکسام-گیلبرت

مبنای روش ماکسام و گیلبرت هضم شیمیایی بوده که در سال 1977-1976 ابداع شد. در این روش نیازی به پلیمریزاسیون قطعه DNA نیست. در مرحله اول ابتدا به انتهای ′5 DNA دو رشته‌ای یک گروه فسفات (P32) که خاصیت رادیواکتیو دارد، اضافه می‌شود. سپس توسط یک آنزیم محدود الاثر یک انتهای این قطعه بریده شده و با گرم کردن DNA و افزودن مجموعه‌ای از مواد شیمیایی از جمله گلیسرول، آن را تک رشته‌ای می‌کنند.

در مرحله بعد رشته‌ای که انتهای آن فسفات رادیواکتو لیبل شده دارد با استفاده از الکتروفورز جدا می‌شود و از طریق اتورادیوگراف روی ژل ظاهر شده و تخلیص می‌شود (۱). قطعه تک رشته به داخل 4 لوله آزمایش مختلف منتقل می‌شود. سپس هر کدام از لوله‌های آزمایش با نوعی ماده شیمیایی خاص تیمار می‌شوند. ماده‌های شیمیایی رشته را در محل باز مربوطه می‌شکنند. در واقع واکنش به گونه‌ای طراحی می‌شوند که قطعاتی با طول‌های مختلف ایجاد شوند.

برای مثال افزودن نمک (کلرید سدیم) به واکنش هیدرازین سبب مهار واکنش تیمین برای واکنش C می‌شود، پورین (A+G) با استفاده از اسید فرمیک پورین زدایی می‌شود، گوانین (و تا حدی آدنین) توسط دی متیل سولفات متیله می‌شود و پیریمیدین (C+T) با استفاده از هیدرازین هیدرولیز می‌شود. در نتیجه مجموعه‌ای از قطعات مختلف تولید می‌شود. این قطعات در ژل الکتروفورز از یکدیگر جدا شده و سپس خوانده می‌شوند. قطعات هر چهار واکنش در ژل آکریل آمید تفکیک و الکتروفورز می‌شوند تا به ترتیب اندازه جدا شوند.

برای نمایش و مرئی سازی بخش‌ها، ژل مورد نظر در معرض اشعه X قرار می‌گیرد تا اتورادیوگرافی انجام شود و نوارهای تیره‌ای را که بیانگر مکان مولکول رادیواکتیو شده است را نمایش دهد. از حضور یا غیبت برخی قسمت‌ها می‌توان توالی رشته را استنباط کرد. به این ترتیب که اگر نواری در هر دو واکنش  C+t و C باشد یعنی در آن مکان باز C قرار دارد. اگر تنها در C+t نواری داشته باشیم یعنی در آن محل باز T خواهیم داشت. به صورت مشابه استدلال‌هایی برای بازهای  A و G وجود دارد (۶).

روش سنگر

(a) نشان دهنده توالی یک رشته از DNA است. (b) توالی‌یابی به روش خاتمه زنجیره یا سنگر. (c) توالی‌یابی به روش ماکسام-گیلبرت. (d) قطعات به دست آمده از هر دو روش بر روی ژل آکریل آمید قابل مشاهده شده‌اند.

 

گسترش روش‌هایی مانند واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و فن آوری DNA نوترکیب با فراهم آوردن مقدار قابل توجهی DNA که ماده اولیه برای توالی‌یابی محسوب می‌شود، انقلابی در ژنومیکس ایجاد کرد. در نهایت توالی‌ یاب‌های جدید دی دئوکسی مانند ABI PRISM توسط Applied Biosystems تولید شد که قادر به توالی‌یابی همزمان هزاران نمونه بود (۱).

نسل دوم توالی‌ یابی

با ظهور علومی مانند نانوتکنولوژی و بیوانفورماتیک روش‌های جایگزینی جهت افزایش سرعت و افزایش بازدهی تعیین توالی DNA ابداع شده است که Next Generation Sequencing نامیده شد. این تکنیک‌ها نیازی به ژل و کلونینگ ندارند و از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز جهت ازدیاد قطعات استفاده می‌کنند. در نتیجه سرعت و بازدهی بالایی دارند (۴).

روش توالی‌ یابی pyrosequencing

با پیشرفت‌های ایجاد شده در زمینه‌های نانوتکنولوژی و بیوانفورماتیک روش‌های جایگزینی جهت افزایش سرعت و افزایش بازدهی تعیین توالی DNA ابداع شده است. همزمان با توسعه توالی یابی دی دئوکسی در مقیاس بزرگ، تکنیکی دیگری که تفاوت چشمگیری با تکنیک‌های قبلی داشت ظاهر شد.

تفاوت اصلی این روش با روش‌های موجود استفاده از dNTPهای دارای برچسب رادیواکتیو یا فلئورسنت بود. در حقیقت محققان از روش لومینسانس برای اندازگیری سنتز پیروفسفات استفاده کردند. این روش شامل فرایندی دو آنزیمی بود: در واکنش اول ATP سولفوریلاز پیروفسفات را به ATP تبدیل می‌کند و سپس ATP تولید شده به عنوان سوبسترا برای آنزیم لوسیفراز مصرف شده و لوسیفراز تولید نور متناسب با مقدار پیروفسفات می‌کند. این سیگنال نوری توسط دوربین‌های حساس به سیگنال‌های ساطع شده موسوم به CCD به‌صورت یک پیک ثبت می‌شود. از آنجا که نوکلئوتیدهایی که در هر مرحله اضافه می‌شوند مشخص و یکسان هستند، می‌توان بر اساس تولید این پیک، توالی DNA را در حین سنتز بدست آورد. آنزیمی به نام آپیراز در هر مرحله نوکلئوتیدهای قبلی را جهت اضافه کردن نوکلئوتیدهای جدید از محیط حذف می‌کند. آپیراز یک آنزیم نوکلئوتیداز می‌باشد (۱،۶).

توجه داشته باشید که علیرغم تفاوت‌ها در روش سنگر و pyrosequencing اساس توالی یابی در هر دو روش سنتز رشته اسید نوکلئیک است که تکینیک‌های SBS نامیده می‌شوند. زیرا هر دو نیاز به عمل مستقیم DNA پلیمراز برای تولید و مشاهده محصول دارند (برخلاف روش ماکسام و گیلبرت) (۶). روش pyrosequencing توسط P°al Nyr´en و همکارانش پی ریزی شد (۱). از جمله مزایای این روش به شرح زیر می‌باشد:

  • استفاده از دئوکسی نوکلئوتیدهای طبیعی
  • عدم استفاده از الکتروفورز که فرایندی طولانی و زمان‌بر محسوب می‌شود و نتایح در همان لحظه قابل مشاهده است.
  • این سیستم نیازی به کلونینگ نداشته و از پروسه PCR جهت ازدیاد قطعه مورد نظر استفاده می‌کند. این امر منجر به افزایش سرعت و بازدهی تعیین توالی DNA می‌شود.

روش pyrosequencing در سال 2005 توسط شرکت 454 Life Sciences (و بعدها توسط شرکت Roche) خریداری شد و به اولین تکنولوژی تجاری تحت عنوان NGS تبدیل شد. از آن پس اصطلاح NGS جهت توصیف مجموعه‌ای از فناوری‌ها با قدرت بالاتر نسبت به توالی‌یابی به شیوه سنگر مورد استفاده قرار گرفت (۴).

تکنولوژی تجاری pyrosequencing قادر به توالی‌ یابی تعداد زیادی از قطعات DNA در یک ران بود. در مرحله اول DNA به قطعات 300 تا 500 جفت بازی شکسته شده و سپس با استفاده از آداپتور به بیدهای فلزی متصل می‌شود. در این روش آداپتور دو نقش مهم ایفا می‌کند: از آنجا که آداپتورهای انتهای ′5 خود دارای گروه بیوتین و بیدهای فلزی با استرپتوآویدین پوشیده شده‌اند، اولین نقش آداپتورها اتصال قطعات DNA تک رشته‌ای به بیدهای فلزی کوچک است. در واقع اتصال به‌واسطه تمایل بالای استرپتوآویدین به بیوتین انجام می‌گیرد. آزمایش به گونه‌ای طراحی شده است که به هر بید یک قطعه DNA تک رشته متصل می‌شود.

در مرحله بعد هر بید در یک قطره آب در امولسیون روغن قرار می‌گیرد و واکنش زنجیره‌ای پلیمزار آب در امولسیون روغن (emPCR) انجام می‌شود. اصطلاحاً به این فضا (قطره آب در امولسیون روغن) میکرورآکتور گفته می‌شود. سپس واکنش PCR جهت تکثیر قطعه DNA انجام می‌شود. میکرورآکتور حاوی همه مواد مورد نیاز جهت تکثیر DNA تک رشته است.

نقش دوم آداپتورها فراهم کردن جایگاهی برای اتصال پرایمر و تکثیر قطعه مد نظر است. از آنجا که این تکنیک نیازمند DNA الگو تک رشته‌ای می‌باشد، پس از پایان مرحله تکثیر، محصولات PCR دناتوره می‌شوند. بدین ترتیب پس از تکثیر بر روی هر دانه در حدود 1 میلیون قطعه DNA تک رشته جهت تعیین توالی ایجاد می‌شود. هدف از انجام مرحله  PCR، افزایش تعداد قطعه هدف است تا شدت سیگنال دریافتی تقویت شده و درنتیجه شناسایی بهتری توسط دستگاه detector در مرحله تعیین توالی‌یابی صورت پذیرد.

در مرحله بعد امولسیون شکسته می‌شود و محتویات درون آن به چاهک‌های پیکولیتری در سطح یک پلیت منتقل می‌شود. در داخل هر چاهک تنها یک بید قرار می‌گیرد. سپس آنزیم‌های مورد نیاز شامل سولفوریلاز، لوسیفراز و آپیراز به همراه سایر مواد مورد نیاز برای تکثیر به هر چاهک جهت انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، افزوده می‌شود. به این ترتیب پایروسکوئنسینگ در هر چاهک انجام می‌گیرد. در این تکنیک می‌توان بیش از یک میلیون نمونه را به طور همزمان تعیین توالی کرد (۱، ۵).

اولین ماشین توالی‌یابی با مقیاس بزرگ _high-throughput sequencing یا HTS_ که به‌صورت گسترده توسط مشتریان استفاده شد GS 20 نام داشت که بعدها به 454 GS FLX با تعداد بیش‌تر چاهک در پلیت پیکوتیتر ارتقا یافت .این دستگاه قادر بود تعداد قطعه بیش‌تری را توالی‌یابی کند. توالی‌یابی تعداد هنگفتی واکنش در یک پلیت به طور همزمان و تصویربرداری با وضوح و کیفیت بالا از جمله ویژگی‌‌های نسل دوم توالی‌یاب‌های DNA بود. تکنیک‌های دیگری همزمان با کاربرد موفقیت‌آمیر به‌وجود آمد. مهمترین آن‌ها روش Ion Torrent و Solexa بود. در ادامه به بررسی این تکنیک‌ها پرداخته می‌شود (۱).

روش توالی‌ یابی (Semiconductor Sequencing (Ion Torrent

این روش با نام ‘post-light sequencing’ نیز معرفی می‌شود و در سال 2010 توسط شرکت Life Technologies ارائه شد. مراحل آماده‌سازی و تعیین توالی این تکنیک به pyrosequencing بسیار مشابه می‌باشد. از emPCR برای تکثیر قطعات استفاده می‌شود. در این روش از یک سیستم شناسایی نیمه رسانا استفاده می‌شود.

در روش Ion Torrent تعیین توالی برخلاف روش نوری (از نورهای فلورسنت و یا لومینسانس) که در سایر سیستم‌ها استفاده می‌شود، از شناسایی یون هیدروژن که در هنگام سنتز DNA آزاد می‌شود، استفاده می‌کند. اگر نوکلئوتیدی که به محیط وارد می‌شود، مکمل نوکلئوتیدهای DNA هدف باشد، یک یون‌ هیدروژن آزاد می‌شود. در نتیجه یک واکنش در حسگر فوق حساس یونی رخ می‌دهد. در واقع از تغییرات pH ناشی از رها شدن یون +H هنگام سنتز رشته DNA، برای تشخیص نوکلئوتیدها استفاده می‌شود. تغییرات pH توسط صفحات حسگر فوق حساس یونی که در زیر چاهک‌ها تعبیه شده شناسایی شده و بصورت تغییرات ولتاژ ثبت می‌شوند. در نهایت این تغییرات به‌صورت یک پیک در نمایشگر ظاهر می‌شود. از آنجا که در این روش نیز در هر مرحله نوکلئوتیدهای مشابه و مشخص به مخلوط واکنش افزوده می‌شود، می‌توان بر اساس تولید این پیک، توالی DNA را در حین سنتز بدست آورد.

روش Ion Torrent با حذف نیاز به مواد فلورسنت و دوربین سبب افزایش سرعت توالی‌یابی و کاهش هزینه‌ها شده است. بعدها دومین دستگاه تعیین توالی این شرکت با نام Ion proton را در سال 2012 عرضه شد که میزان خروجی آن افزایش چشمگیری داشت (۵ و ۲).

روش توالی‌ یابی (Illumina (Solexa

این تکنیک توسط شرکت Illumina در سال 2007 ارائه گردید. در این تکنیک به جای تکثیر به واسطه بید و emPCR یا bead-based emPCR از ملکول‌های آداپتوری استفاده شد که روی یک سطح جامد ثابت شده بودند. روند کار به این صورت است که در ابتدا ژنوم مورد نظر به قطعات DNA صد تا 150 جفت بازی شکسته می‌شود. سپس به دو انتهای هر قطعه آداپتور متصل می‌شود و قطعات، تک رشته‌ای می‌شوند. قطعات به‌صورت تصادفی روی سطح جامدی که با توالی‌های مکمل آداپتور پوشیده شده است، توزیع می‌شوند. در نتیجه هر قطعه از DNA بر روی سطح جامد ثابت می‌شود.

در مرحله بعد انتهای آزاد این قطعات نیز به توالی‌های مکمل آداپتور متصل شده و یک پل تشکیل می‌دهند. سپس تکثیر این پل با افزودن مواد مورد نیاز PCR آغاز می‌شود که در اصطلاح به این فرآیند، bridge amplification یا  Bridge PCR گفته می‌شود. توالی‌های مکمل آداپتور به نقش پرایمر دارند. پس پایان هر سیکل، DNA دو رشته‌ای حاصل دناتوره شده تا دوباره PCR انجام گیرد. این واکنش تا زمانی که تعداد زیادی از قطعه مورد نظر ایجاد شود، تکرار می‌شود. هدف، افزایش تعداد قطعه مورد نظر به منظور تقویت شدت سیگنال می‌باشد.

از آنجا که این تکنیک نیز نیازمند DNA تک رشته به عنوان الگو می‌باشد، پس از اتمام مرحله تکثیر، محصولات PCR باید دناتوره شوند. در این حالت ست‌هایی در حدود 1000 کپی از DNA تک رشته به‌صورت تصادفی بر روی سطح جامد ایجاد می‌شود که به هر کدام DNA Polony گفته می‌شود. هر پلونی حاوی یک قطعه DNA می‌باشد. در این روش حداقل 40 میلیون پولونی به طور همزمان تعیین توالی می‌شود. جهت تعیین توالی هر پلونی، مواد مورد نیاز برای واکنش PCR شامل پرایمر، نوکلئوتیدهای ختم دهنده و DNA پلیمراز، به سطح صفحات جامد اضافه می‌شود.

پرایمرهای مورد استفاده، مکمل توالی‌های آداپتور هستند. در این تکنیک از از نوکلئوتیدهای ختم دهنده به نام  3′-blocked reversible terminator nucleotides استفاده می‌شود. هر کدام از این نوکلئوتیدها، با یکی از 4 رنگ فلورسانس (سبز، قرمز، آبی و نارنجی) لیبل می‌شوند. برخلاف ddNTPهای مورد استفاده در تکنیک سنگر، این نوکلئوتیدها خاصیت برگشت‌پذیری دارند. به این معنی که پس از اینکه لیبل رنگی آن‌ها به واسطه detector شناسایی شد، پلیمریزاسیون رشته ادامه می‌‌یابد و متوقف نمی‌شود. زیرا پس از آزاد شدن لیبل رنگی گروه terminator که انتهای ′3 این نوکلئوتیدها را بلوکه کرده نیز جدا می‌شود و در نتیجه اثر مهاری آن برداشته شده و گروه 3′-OH نمایان می‌شود. در نتیجه تکثیر رشته در حال سنتز ادامه می‌یابد. در حقیقت نقش این نوکلئوتیدهای ختم دهنده ایجاد یک وقفه کوتاه در تکثیر رشته در حال سنتز جهت شناسایی لیبل رنگی آن و در نتیجه مشخص شدن نوع آن نوکلئوتید جهت تعیین توالی می‌باشد.

در این تکنیک نوکلئوتیدها بر خلاف روش pyrosequencing و یا Ion Torrent که بصورت مجزا از یکدیگر در هر مرحله افزوده می‌شوند، به صورت همزمان به مخلوط واکنش در هر مرحله اضافه می‌شود و بر اساس لیبل‌های فلورسانس متفاوتی که دارند از یکدیگر متمایز می‌شوند. همچنین در روش Solexa، پس از اتمام هر مرحله به منظور حذف نوکلئوتیدهایی که در زنجیره در حل ساخت وارد نشده‌اند یک شستشو انجام می‌گیرد سپس مرحله بعدی آغاز می‌شود. در حالی که در تکنیک pyrosequencing و یا Ion Torrent از آنزیم آپیراز برای حذف نوکلئوتیدها استفاده می‌شود (۵، ۱، ۲).

نسل دوم توالی یابی

a- امولسیون PCR

b- bridge PCR در روش Solexa/Illumina

c- مرئی سازی با استفاده از رنگ فلورسنت

نسل سوم توالی‌ یابی

تعیین توالی نسل سوم روی ملکول DNA منفرد انجام می‌شود و نیازی به واکنش PCR برای آماده سازی نمونه نیست. همچنین طول قطعات در حدود 8-6 کیلوباز می‌باشد که بسیار بلندتر از طول توالی خوانده شده سایر روش‌های NGS است. طول بلندتر قطعات کاهش زمان و هزینه و خطای خوانش را در پی دارد. در تکنیک‌های نسل سوم نیازی به تکثیر قطعات DNA نیست. این تکنیک‌ها به SMS یا single molecule sequencing نیز معروف هستند و اولین بار توسط Stephen Quake پایه ریزی شدند. در نهایت توسط شرکت Helicos BioSciences تجاری سازی شدند (۱).

روش توالی‌ یابی SMRT یا single molecule real time

امروزه پرطرفدارترین تکنولوژی تعیین توالی نسل سوم پلت فرم (SMRT) شرکت Pacific Biosciences و ماشین توالی‌یاب PacBio است. این روش بر اساس فرایند طبیعی همانندسازی DNA طراحی شده است و از کارایی و درستی بالایی برخوردار است. فناوری SMRT مشاهده سنتز DNA را در همان زمان وقوع امکان‌پذیر می‌سازد.

در این تکنیک از چیپ‌هایی استفاده می‌شود که دارای یک فیلم فلزی بسیار باریک می‌باشند. این فیلم فلزی حاوی هزاران حفره بوده که به آن‌ها ZMW یا Zero-Mode Waveguid گفته می‌شود. قطر ZMW، دو و نیم نانومتر و حجم آن در حدود 20 زپتولیتر می‌باشد. همچنین در کف هر چاهک‌ یک آنزیم DNA پلیمراز تثبیت شده است و پلیمریزاسیون در این ناحیه انجام می‌شود. این چاهک‌ها توسط دوربین‌های CCD رصد می‌شوند. این امر امکان تعیین توالی همزمان با سنتز در زمان واقعی را فراهم آورده است.

ابتدا ژنوم به قطعاتی به طول 1500 جفت باز شکسته شده و به دو سمت هر قطعه آداپتور متصل می‌شود. آداپتوری که در این روش استفاده می‌شود تفاوت خاصی با آداپتورهای مورد استفاده در سایر روش‌ها دارد. آن‌ها آداپتورهای سنجاق سری نام دارند و به قطعه مورد نظر متصل می‌شوند قطعه مورد نظر حلقوی می‌شود. در مرحله بعد یک پرایمر به هر کدام از آداپتورها متصل می‌شود. در نهایت واکنش پلیمریزاسیون با استفاده از نوکلئوتیدهایی که هر کدام با رنگ خاصی لیبل شده اند در داخل هر یک از چاهک‌ها انجام می‌شود.

با اتصال نوکلئوتید نشان‌دار به جایگاه فعال DNAپلیمراز، رنگ فلورسنت شناسایی می‌شود. در این روش به جای استفاده از باز نشاندار از فسفات گامای نشاندار با مواد فلورسنت استفاده شده است. در نتیجه ضمن ورود نوکلئوتید به رشته در حال سنتز فلوروفور همراه پیروفسفات آزادشده و درنتیجه هیچ گونه ممانعت فضایی برای طول رشته در حال ساخت ایجاد نمی‌کند و همین امر سبب افزایش طول توالی خوانده شده می‌شود. همچنین شناسایی فلوروفور آزادشده به ناحیه‌ای بسیار کوچک در کف چاهک‌ها محدود می‌شود (توسط متمرکز کردن نور لیزر) بنابراین حضور مخلوطی از نوکلئوتیدهای نشاندار هنگام انجام واکنش بلامانع بوده و سنتز رشته جدید به صورت فرایندی پیوسته دنبال می‌شود (۵،۱).

این فرایند می‌تواند ملکول‌های منفرد را در مدت زمان بسیار کوتاهی تعیین توالی کند. روش SMRT دارای مزایای ارزشمندی نسبت به سایر تکنیک‌ها است:

  • این تکنیک قادر به تعیین توالی قطعات بسیار طولانی بیش از ده کیلو باز هستند.
  • نتیجه توالی در یک روز آماده می‌شود.
  • امکان تجزیه و تحلیل منحصر به فرد تک ملکلول در تشخیص نوع توالی خاصی ازیک سلول به سلول دیگر را فراهم می‌کند.

این روش در سال 2011 توسط شرکت Oxford Nanopore Technologies ارائه شد. در این روش نانوحفره‌هایی روی غشا (زیستی یا مصنوعی) ایجاد می‌شود که حاوی کانال‌هایی (به‌طور عمده از جنس آلفا-همولایزین) به قطر 1 الی 2/5 نانومتر است. و غشا زیستی در یک محلول نمکی غوطه‌ور است. قطر داخلی کانال‌ها به گونه‌ای طراحی شده که تنها DNA تک رشته از داخل آن عبور می‌کند. با برقراری جریان الکتریکی منجر به هدایت یون‌ها از نانوحفره‌ها در جهت شیب غلظت می‌شود. ورود مولکول DNA به داخل نانوحفره در برابر جریان عبوری یون‌ها مقاومتی ایجاد می‌کند. این مقاومت منجر به تغییر شدت جریان عبوری از هر منفذ می‌شود. تغییر شدت جریان تولید شده برای هر نوع نوکلئوتید برحسب اندازه و شکل فضایی متفاوت و قابل سنجش توسط دستگاه Nanopore است (۱، ۵).

نسل سوم توالی یابی

(a) بررسی نوکلئوتید در یک ZMW در روش SMRT

(b) توالی‌یابی Nanopore

کاربردهای توالی‌ یابی DNA

توالی‌ یابی DNA می‌تواند برای تعیین توالی تک ژن‌ها، نواحی ژنتیکی با طول زیاد مانند کلاسترها یا ژن‌های اپرون‌ها، ‌توالی کامل کروموزوم یا کل ژنوم یک ارگانیسم استفاده شود. این روش بهترین و کارآمدترین راه برای تعیین توالی RNA یا پروتئین نیز می‌باشد. در واقع توالی‌ یابی DNA یک فناوری کلیدی در بسیاری از زمینه‌های زیست شناسی است.

توالی‌ یابی نسل جدید در ارگانیسم‌های مختلف مانند انسان، گیاهان، حیوانات، باکتری‌ها و ویروس‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. DNAی مورد استفاده جهت توالی‌یابی می‌تواند از منابع مختلفی تامین شود. به عنوان مثال جهت توالی‌ یابی ژنوم (whole genome sequencing) و بررسی نواحی متیله شده (Methyl-Seq) از DNA ژنومی، جهت توالی‌ یابی RNA یا RNA-Seq از cDNA یا DNAی مکمل و جهت تعیین محل‌ اتصال عوامل رونویسی (ChIP-Seq) از immunoprecipitated DNA استفاده می‌شود. این روش‌ها به طور گسترده در بسیاری از زمینه‌های تحقیقاتی مورد استفاده قرار می‌گیرند. سرعت بالا و هزینه‌ی پایین توالی‌ یابی باعث شده است تا این روش‌ها کاربردهای فراوانی در زمینه‌های زیست‌شناسی داشته باشند و نتایج حاصل کمک شایانی به درک مکانیسم‌های ملکولی می‌کند.

شناسایی واریانت‌های مختلف با استفاده از توالی‌ یابی کل ژنوم (Whole genome sequencing)

شناسایی واریانت‌های ژنتیکی یک صفت خاص از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. به طور مثال واریانت‌هایی که برخی افراد را نسبت به سایرین مستعد ابتلا به یک بیماری می‌کند یا واریانت‌های مرتبط به یک صفت مهم در گیاهان مانند مقاومت به تنش‌های زیستی و غیر زیستی یا عملکرد از ابتدا مورد توجه بوده است. مطالعه بر روی کل ژنوم از طریق توالی‌ یابی در ابتدا بر روی واریانت‌هایی که در جامعه شایع هستند انجام می‌گرفت اما بادست‌یابی به روش‌های NGS و توالی‌ یابی کل ژنوم امکان بررسی واریانت‌هایی با فراوانی کمتر را فراهم کرد. به عنوان مثال در طرح ۱۰۰۰ ژنوم واریانت‌هایی با فراوانی کمتر ار یک درصد مورد بررسی قرار گرفتند.

توالی‌ یابی مناطق هدف (Targeted sequencing)

اگرچه توالی‌ یابی کل ژنوم با استفاده از تکنیک‌های NGS ژنوم یک روش بهینه و جامع‌ می‌باشد، اما در بسیاری از آزمایشگاه‌های تحقیقاتی و بالینی در دسترس نیست. در نتیجه توالی‌ یابی برخی توالی‌های خاص که جهش یا تغییرات دیگر آن‌ها موجب بیماری می‌شود مورد توجه قرار گرفته است. امروزه از پلت‌فر‌های مختلف NGS به منظور Exome sequencing در بیماری‌هایی که چندین ژن مختلف مستعد برای جهش دارند و یا بدون نقاط Hot spot برای جهش می‌باشند، استفاده می‌شود.

مواردی که در آن توالی‌ یابی اگزومی توصیه می‌شود عبارت است از فنوتپ‌های هتروژن،‌ فنوتپ‌های کاملاً نامشخص و یا مجموعه‌ای از علائم که تشخیص افتراقی را با مشکل مواجه می کنند ودر نهایت ژن های بزرگ نظیر ژن دیستروفین. از جمله موارد توالی‌یابی هدفمند می‌توان به بیماری‌های نقص ایمنی و سرطان‌هایی مانند کولورکتال و یا سینه اشاره نمود که می‌تواند حاصل جهش در یک سری ژن‌های هدف باشد و یا به عنوان مثال برای بررسی تغییر طول میکروستلایت‌ها (Microsatellite instability by next-generation sequencing : mSINGS) در طول سرطان کلورکتال. این موارد هم در تشخیص و نوع سرطان و هم در درمان آن بسیار مفید می‌باشد.

توالی‌ یابی از نو به مفهوم تولید توالی اولیه (De novo sequencing and assembly)

برای موجوداتی که اطلاعات ژنتیکی محدودی از آن‌ها در دسترس است از نوعی روش به نام تعیین توالی از نو و اسمبلی ژنومی یا ترانسکریپتومی استفاده می‌شود. در سال ۲۰۰۷ ژنوم پیچیده و هتروزیگوت انگور با استفاده از ترکیب روش‌های سنگر و pyrosequencing انجام شد. در این پروژه برای اولین‌بار توالی‌های خوانده شده با روش‌های سنگر و NGS یک ژنوم پیچیده یوکاریوتی با موفقیت اسمبل شد.

 تعیین توالی RNA یا RNA-seq

توالی یابی total RNA یا RNAی کل از جمله کابردهای مهم توالی‌یابی است که امروزه به طور گسترده از آن استفاده می‌شود. با استفاده از این تکنیک امکان بررسی تمام انوع مختلف نسخه‌های موجود در سلول اعم از RNAهای کد کننده و غیر کد کننده مانند میکروRNAها، lncRNA و cirRNA وجود دارد. این تکنیک برای انجام تحقیقات ژنتیکی و ملکولی در موجودات غیر مدل که اطلاعات ژنتیک بسیار اندکی از آ‌ن‌ها موجود است کاربرد زیادی دارد.

بررسی تغییرات اپی‌ژنتیک

ارتباط پروتئین و DNA از جمله واکنش‌های مهم زیستی است و نقش مهمی در بسته بندی و قابل دسترس بودن DNA جهت تنظیم بیان ژن‌ها دارد. بررسی تغییرات پروتئین‌های هیستونی و نوکلئوزوم‌ها و پروفایل پروتئین‌های متصل شده به DNA در مقیاس ژنومی با استفاده از تکنیک chromatin immunoprecipitation انجام می‌شود. در این تکنیک ابتدا رسوب‌دهی ایمونوکروماتینی و تفکیک پروتئین‌ها انجام شده و سپس با حذف پروتئین، DNA تعیین توالی می‌شود.

با استفاده از این روش می‌توان جایگاه اتصال برخی عوامل رونویسی و ژن‌های تحت کنترل آن را شناسایی کرد. همچنین به منظور نقشه یابی الگوی متیلاسیون ژنوم و شناسایی نواحی که به طور افتراقی متیله شده‌اند (DMR: Differetial methylated region) از تکینکی Methyl-Seq استفاده می‌شود. این تکنیک شامل روش‌های مختلف مانند MeDIP-Seq ،MethylC-seq ،bisulfite sequencing و RRBS می‌باشد. به عنوان مثال تعیین الگوی متیلاسیون ژن‌های دخیل در ایجاد سرطان‌ها از جمله کاربردهای مهم این تکنیک است.

توالی یابی تک سلول (Single-cell sequencing)

گاهی کمبود بافت مورد نظر، دستیابی به میزان کافی از DNA یا RNA را محدود می‌کند. به عنوان مثال در بافت‌های سخت توموری که بسیار هتروژن هستند و همراه سلول‌های سالم می‌باشند تهیه ماده اولیه کافی میسر نیست و با مشکلات زیادی همراه است. تکنیک‌های NGS به میزان DNAی اولیه کمی نیاز دارند بنابراین می‌توان به صورت تک سلول به توالی‌ یابی کل ژنوم پرداخت و به تعداد کلون‌های ایجاد کننده سرطان پی برد.

توالی‌ یابی اسیدهای نوکلئیک آزاد موجود در خون و سایر مایعات بدن

DNA یا RNA آزاد در مایعات بدن به ویژه خون یک رویکرد جدید تشخیص و پیش آگهی دهنده در زمینه‌ی بسیار از بیماری‌ها مانند سرطان و یا تشخیص‌های پیش از تولد در بیماری‌های تک ژنی و یا کرورموزمی می‌باشد. اسیدهای نوکلئیک موجود در خون دارای میزان کمی هستند بنابراین بررسی آن‌ با مشکلات فراوانی مواجه بود اما امروزه می‌توان با استفاده از توالی‌یابی کل DNA یا RNA موجود در این مایعات به راحتی هرگونه مشکل را تشخیص داد.

کاربردهای دیگر توالی یابی

سایر کاربردهای توالی یابی شامل بررسی تعامل Long non-coding RNA یا lnc-RNA و کروماتین، تعیین نواحی باز یا در دسترس یوکروماتین Chromatin isolation by RNA purification seq یا ChIRP-seq و همچنین کاربرد در حوزه متاژنومیک اشاره کرد. متاژنومیکس شناسایی و مطالعه ماده ژنتیکی میکروبی است که به طور مستقیم از نمونه‌های محیطی بدست آمده است. شناسایی ارگانیسم‌های موجود در یک محیط خاص برای تحقیقات بوم‌شناسی، بیماری‌شناسی، میکروب‌شناسی حیاتی است. توالی‌یابی به محققان این امکان را می‌دهد تا به عنوان مثال انواع میکروب‌های موجود در یک میکروبیوم را شناسایی کنند (۸).

مزایا و معایب توالی‌ یابی نسل جدید

علاوه بر کاربردهای این نسل از توالی‌ یابی که ذکر شد، می‌توان به ویژگی‌هایی از جمله پوشش دهی بالا (عمق پوشش دهی99X)، نیاز به میزان کم از نمونه ژنومی (50ng)، توالى‌ یابی تک مرحله ای، مقیاس‌پذیری بسیار بالا، پروتکل‌های آماده سازی نمونه سریع و مستقیم و کاهش زمان و هزینه‌ها اشاره نمود.

بزرگترین چالش‌ این تکینک‌ها تجزیه و تحلیل داده‌ها می‌باشد که در سطح آزمایش‌های تحقیقاتی قابل انجام بوده اما در سطح بالینی هنوز نیاز به تسریع استفاده از این داده‌ها و ترجمه جفت بازهای توالی در برنامه‌های کاربردی بالینی است. چالش بعدی، زیر ساخت‌های محاسباتی می‌باشد. در واقع مقدار داده‌های اولیه در سیستم‌های NGS از ظرفیت محاسباتی‌ترین سیستم‌ها نیز پیشی گرفته‌اند. چالش بحث برانگیز دیگر، مسائل حقوقی و اخلاقی این روش می‌باشد. پیامدهای قانونی و اخلاقی تعیین توالی بسیار زیاد است و تاکنون به طور کامل به آن پرداخته نشده است. به اشتراک گذاری اطلاعات ژنتیکی فرد با کارفرمایان و شرکت‌های بیمه آینده نگر ممکن است منجر به تبعیض مبتنی بر اطلاعات ژنتیکی شود که می‌تواند پیامدهای قانونی داشته باشد (۹).

بحث در مورد توالی یابی

تکنیک NGS را می‌توان برای انواع ارگانیسم‌ها از جمله باکتری‌ها گیاهان انسان و حیوانات و غیر ه استفاده نمود. در سال‌های اخیر تغییرات در شیوه‌های تعیین توالی شتاب گسترده‌ای یافته است. تعیین توالی به ابزاری کاربردی، متداول و استاندارد برای آزمایشگاه‌های بالینی و تحقیقات زیستی تبدیل شده است. تکنیک‌های تعیین توالی، انقلاب بزرگی را در عرصه زیست شناسی مولکولی ایجاد کرده‌اند.

از زمان معرفی تعیین توالی بر پایه سنگر، بسیاری از تکنیک‌ها در جهت افزایش بازدهی تعیین توالی و به طبع کاهش هزینه این پروسه، توسط شرکت‌های مختلف ارائه شده است. شرکت‌هایی از قبیل Pacific Biosciences و Life Sciences454، خود را به واسطه طول خوانش‌های بیشتر از سایر شرکت‌ها متمایز کرده‌اند. در مقابل شرکت‌هایی از قبیل Illumina و lonTorrent به واسطه هزینه‌های پایین‌تر تعیین توالی، نظر بسیاری از مشتریان را به سوی خود جلب کرده‌اند. تکنیک‌هایی از قیبل Solid با وجود طول خوانش‌های کوچکتر، به دلیل بازدهی بیشتر مطرح شده‌اند و یا ابزارهای جدیدی از قبیل نانو پورها که بواسطه شرکت Oxford Nanopore Technologies ارائه شده است، با هزینه بسیار اندک ولی با میزان خطای بیشتر عمل تعیین توالی را انجام می‌دهند. این تکنولوژی در حال پیشرفت روز افزون می‌باشد به طوری که امروزه چندین روش دیگر شامل توالی‌یابی Tunnelling currents DNA، توالی‌یابی با استفاده از هیبریداسیون (Sequencing by hybridization)، توالی‌یابی با استفاده از طیف‌سنجی جرمی (Sequencing with mass spectrometry)، توالی‌یابی میکروفلوئیدیک سنگر (Microfluidic Sanger sequencing)، توالی‌یابی مبتنی بر تکنیک‌های میکروسکوپی (Microscopy-based techniques) و توالی‌یابی RNAP در حال توسعه می‌باشند (۱۰).

از این رو، اولین و مهم ترین امر در تکنیک‌های تعیین توالی این است که محققین بر اساس ویژگی‌های طرح پژوهشی خود، مناسب ترین روش توالی یابی را از نظر کارایی انتخاب نمایند. نسل‌های جدید فناوری تعیین توالی هیچ یک به صورت کامل جایگزین شیوه‌های قبلی نمی‌شوند و در واقع روش‌های مختلف برحسب هدف مورد بررسی امکان درک کامل و همه جانبه ژنوم را فراهم می‌نمایند.

منابع مقاله توالی یابی

1- Heather, J. M., & Chain, B. (2016). The sequence of sequencers: the history of sequencing DNA. Genomics, 107(1), 1-8.
2- Mosallayi M, Mirzaei H, Simonian M, Kheirollahi M. Next-Generation Sequencing and Applications. J Isfahan Med Sch 2016; 33(368): 2469-80
3- Pourmoshir N, Mohamadi Farsani F, Vallian Borujeni S. Next generation sequencing and its application in diagnosis of genetic diseases. 3. 2017; 8 (34) :56-66

4- صادقی، مهدی، ۱۳۹۰، نسل جدید توالی یابی DNA، هفتمین همایش بیوتکنولوژی جمهوری اسلامی ایران، تهران، انجمن بیوتکنولوژی جمهوری اسلامی ایران،

5- Sabbaghi A, Soleimani M. An Overview of DNA Sequencing Methods (First Generation, Second Generation and Third Generation). Paramedical Sciences and Military Health. 2016; 11 (2) :48-60

6- توالی‌یابی به روش مکسام-گیلبرت (ویکی‌پدیا)
7-  توالی‌یابی (ویکی‌پدیا)

8- Mosallayi M, Mirzaei H, Simonian M, Kheirollahi M. Next-Generation Sequencing and itsApplications. J Isfahan Med Sch 2016; 33(368): 2469-80
9- Pourmoshir N, Mohamadi Farsani F, Vallian Borujeni S. Next generation sequencing and its application in diagnosis of genetic diseases. 3. 2017; 8 (34) :56-66
10- wikipedia.org

برچسب‌ها:
این مقاله برای شما مفید بود؟
خیر 2 این مقاله برای 19 نفر مفید بوده است.
بازدید: 2797

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

شصـت هشـت + = شصـت نـه

دکمه بازگشت به بالا
EnglishIran
بستن