تست‌های بر پایه‌ی ctDNA ، جایگزین روش‌های تهاجمی موجود در تشخیص سرطان
میانگین زمان مطالعه:12 دقیقه
چکیده
در بسیاری از اختلالات مانند سرطان یا … پزشکان به منظور مطالعه و تشخیص وضعیت بیماری نیاز به نمونه‌گیری از بیمار دارند. با وجود پیشرفت‌های صورت‌گرفته، هنوز هم در بسیاری از موارد از بافت بیمار نمونه‌برداری می‌شود که اکثراً همراه با عمل جراحی یا مشابه آن است. به طور کلی، نمونه‌گیری از بافت‌ها به عنوان بیوپسی جامد، روشی تهاجمی است که تکرار آن در بسیاری از مواقع امکان‌پذیر نیست. در سال‌های اخیر بیوپسی مایع به عنوان جایگزینی در دسترس مطرح شده و مطالعات زیادی در این حوزه صورت گرفته‌است. در این گزارش، ابتدا به توضیحی مختصر در مورد بیوپسی مایع و بیومارکرهای مختلف موجود در آن شامل cfDNA، cfRNA، پروتئین‌ها، سلول‌ها و اگزوزم‌ها می‌پردازیم. در ادامه توضیحات کامل‌تری در مورد روش‌های موجود بر پایه‌ی cfDNA آورده‌شده‌است. تست‌های غیرهجومی والدین به عنوان نخستین تست‌های بر پایه‌ی cfDNA مطرح می‌شوند و سپس به تست‌های توسعه‌یافته در حوزه‌ی سرطان پرداخته می‌شود. تست‌های تشخیصی سرطان بر پایه‌ی ctDNA در قالب سه دسته‌ی کیت‌های تجاری موجود بر پایه‌ی qPCR، کیت‌های تجاری موجود بر پایه‌ی digital PCR و کیت‌های تجاری موجود بر پایه‌ی توالی‌یابی‌های نسل جدید ارائه می‌گردند و مزایا و همچنین چالش‌های موجود در این حوزه بررسی می‌شوند.
نویسنده: سیدسعید متقی، دانشجوی بیوتکنولوژی دانشگاه تهران
مقدمه
بیوپسی مایع (liquid biopsy)، نمونه‌گیری از مایعات بدن مانند خون، ادرار، آب دهان و… با کمترین تهاجم است که به جای بیوپسی جامد (نمونه‌گیری از بافت‌های بدن) به منظور بررسی وضعیت بیماری مورد استفاده قرار می‌گیرد. با توجه غیرتهاجمی بودن تست‌های بیوپسی مایع، در سال‌های اخیر توجه ویژه‌ای به این حوزه شده‌است و تست‌های زیادی توسعه یافته‌اند. بر اساس RNCOS market research، حجم بازار بیوپسی مایع تا سال ۲۰۲۳ از فراتر از ۵ میلیارد دلار می‌رود۱. خون، ادرار، بزاق دهان، مایع مغزی نخاعی (CSF) و تراوشات جانبی ریه مایع‌های مختلفی هستند که به عنوان بیوپسی مایع می‌توانند بررسی شوند۳. خون بیشترین مایعی است که به عنوان بیوپسی مایع مورد استفاده قرار گرفته‌است و بیومارکرهای مختلفی نظیر cfDNA (cell free DNA)، cfRNA (cell free RNA)، پروتئین‌ها، سلول‌ها و اگزوزم‌های نشأت‌گرفته از بافت‌های بدن از جمله بافت‌های سرطانی در آن وجود دارند۱و۲. شکل۱ آنالیت‌های مختلف موجود در خون نشأت گرفته از سرطان پانکراس را نشان می‌دهد۲. شکل ۲ نیز نشان‌دهنده‌ی بیومارکرهای مربوط به سرطان در سایر مایعات بدن است که می‌توانند به عنوان بیوپسی مایع مورد استفاده قرار بگیرند۳.
شکل ۱: آنالیت‌های موجود در خون نشأت گرفته از بافت توموری در سرطان پانکراس۲شکل ۲: آنالیت‌های موجود در سایر مایعات بدن نشأت گرفته از بافت توموری۳
به طور خاص بیوپسی مایع در غربالگری، بررسی بیماری و پیدا کردن درمان مناسب برای سرطان کاربرد دارد. شکل۳ نشان‌دهنده‌ی کاربردهای مختلف بیوپسی مایع در مراحل مختلف سرطان است۴.
شکل ۳: کاربردهای بیوپسی مایع در مراحل مختلف سرطان۴
بیومارکرهای موجود در خون
همان طور که ذکر شد در حوزه‌ی بیوپسی مایع خون کاربردهای بیشتری دارد و عمده‌ی مطالعات بر روی خون انجام شده‌است. در ادامه بیومارکرهای خونی به طور کلی و cfDNA کامل‌تر بررسی می‌شود.
سلول‌هایِ توموریِ درگردش (circulation tumor cells یا CTCs)
شکل ۴: تعیین درمان مناسب بر اساس سلول‌های توموری در گردش۶
سلول‌های توموری در گردش در واقع سلول‌های سرطانی در خون هستند که از تومور جامد نشأت می‌گیرند و عامل اصلی متاستاز به سایر بافت‌ها هستند. تعداد سلول‌های توموری در گردش می‌توانند نشان‌دهنده‌ی میزان پیشروی سرطان باشند که این مطلب با توجه به نوع سرطان متفاوت است. به طور کلی استفاده از این بیومارکر برای شناسایی سرطان به سادگی قابل انجام نیست زیرا در فردی که دچار متاساز شده‌است، به ازای هر ۱۰۹ سلول خونی تنها یک سلول توموری در خون وجود دارد. به علاوه جداسازی سلول‌های توموری در گردش به علت ویژگی‌های سطحی و سایزهای متفاوت کار دشواری است۱.
CELLSEARCH® نخستین پلت فرم تشخیص سرطان بر پایه‌ی سلول‌های در گردش است که تأییدیه‌ی FDA را دارد. این پلت‌فرم با جداسازی سلول‌های توموری در گردش بر اساس مارکرهای سطحی از نمونه‌ی خونی و شمارش آن‌ها، امکان تشخیص سرطان‌های متاستاتیک سینه، روده‌ی بزرگ و پروستات را دارد. این تست تنها به mL۷.۵ نمونه‌ی خونی بیمار نیاز دارد و در حال حاضر در چند آزمایشگاه در آمریکا انجام می‌شود۵.
این بیومارکر با وجود محدودیت‌های جداسازی آن، مزیت‌هایی نسبت به سایربیوماکرهای خونی دارا می‌باشد. از جمله این که سلول‌های توموری در گردش حاوی پروتئین، DNA و RNA هستند و بنابراین اطلاعات جامعی از تومور را نشان می‌دهند۱.
برای مثال تست AR-V7 (androgen receptor splice variant 7) تستی دیگر بر اساس این بیومارکر برای شخصی‌سازی درمان سرطان پروستات استفاده می‌شود. بر اساس نتیجه‌ی این تست مقاومت به درمان‌های بر پایه‌ی آندروژن برای سرطان مشخص می‌شود و اگر فرد به این درمان مقاوم باشد، درمان‌های جایگزین برای او تجویز می‌شود۶.
اگزوزم‌ها
اگزوزم‌ها حاصل اتصال وزیکول‌های دارای چند غشا به غشای پلاسمایی در سطح سلول در فرآیند اگزوسیتوز هستند که به این ترتیب از سلول خارج می‌شوند. اگزوزم‌ها که ابعادی بین ۴۰ تا ۲۰۰ نانومتر دارند، از طریق اتصال به غشای سایر سلول‌ها و آزادسازی محتویات خود شامل DNA،mRNA، miRNA و پروتئین‌ها در سلول هدف، اطلاعات را بین سلول‌ها تبادل می‌کنند. اگزوزم‌ها با توجه به این که غلظت بالایی از نوکلئیک‌اسیدها را در خود دارند، از این منظر نسبت به cfDNAها و cfRNAها مزیت دارند۱.
تا به حال شیوه‌های زیادی برای جداسازی اگزوزم‌ها توسعه یافته‌است که بر پایه‌ی سانتریفیوژ، ابزارهای میکروفلوئیدیک و immunoaffinity هستند. با این حال هنوز امکان جداسازی اگزوزم‌های نشأت گرفته از سلول‌های سرطانی و سلول‌های سالم وجود ندارد و به همین دلیل کاربرد آن‌ها در شناسایی سرطان هنوز عملی نشده‌است۱.
cfRNA
RNAهای موجود در خون شامل mRNAها، miRNAها، lncRNAها و circle RNAها می‌توانند به عنوان بیومارکر برای شناسایی سرطان به کار روند. نخسین بار در سال ۱۹۹۶ mRNAهای مربوط به تومور در بیماران مبتلا به melanoma مشاهده شد. همچنین miRNAها و lncRNAهایی در خون افراد مبتلا به تومورهای جامد شناسایی شده‌است. این بیومارکر حاوی اطلاعاتی فراتر از جهش‌های سوماتیک ایجادشده در تومور است. در یک مطالعه در سال ۲۰۱۹ ترکیبی از داده‌های CT scan و miRNAهای خونی به عنوان ابزاری برای شناسایی سرطان سینه استفاده شده‌است۱.
cfDNA
cfDNAها، DNAهای خارج سلولی هستند که به صورت آزادانه در خون در گردش‌اند و یکی از مهمترین بیومارکرهای مورد استفاده به منظور شناسایی بیماری‌ها به شمار می‌روند. به طور خاص به cfDNAهایی که منشأ آن‌ها بافت‌های سرطانی است ctDNA (circulating tumour DNA) گفته می‌شود. طول ctDNAها حدود bp 134 – 144 است در حالی که cfDNAها به طور میانگین bp۱۶۷ طول دارند. وجود cfDNA در خون انسان نخستین بار در سال ۱۹۴۸ شناسایی شده‌است. منشأ cfDNA خون ترشح از سلول‌ها، آپوپتوز و یا نکروز سلول‌هاست. غلظت cfDNA در خون یک فرد سالم به طور میانگینng ml-۱ ۱۰ – ۱ است و بر اثر حادثه، بیماری و یا عفونت این میزان افزایش می‌یابد. با پیشرفت تکنولوژی شناسایی DNA امکان استفاده از این بیومارکرها در سال‌های اخیر افزایش یافته‌است. با مطالعات بیشتر روی تومورهای سرطانی، مشخص شده‌است که تقریباً تمام سلول‌های سرطانی حاوی جهش‌های سوماتیک هستند و مهم‌تر این که این جهش‌ها در ctDNAهای نمونه‌های خونی بیماران قابل شناسایی هستند. غلظت ctDNA در خون افراد کمتر از ٪۰.۰۱ غلظت cfDNAهای موجود در خون است. بنابراین استفاده از این بیومارکر برای شناسایی زودهنگام سرطان و یا انتخاب شیوه‌ی درمان، با توجه به غلظت پایین آن چالشی جدی است و نیازمند شیوه‌هایی دقیق است که بتواند سیگنال‌های ctDNA را از پس‌زمینه‌ی شدید cfDNAها تشخیص دهد. این مسأله به خصوص در تشخیص زودهنگام سرطان که غلظت ctDNA در حدود پیکوگرم است حائز اهمیت به سزایی است۱.
نمودار زیر نشان‌دهنده‌ی احتمال شناسایی جهش را در نمونه‌ی cfDNA حاوی ۱۰ نسخه‌ی جهش یافته را نشان می‌دهد. در این نمودار محور افقی نشان‌دهنده‌ی درصد واریانت جهش‌یافته (Variant allele frequency) است و رنگ‌های مختلف مربوط به توالی‌یابی با عمق‌های خوانش متفاوت است. همان طور که نمودار نشان می‌دهد در ۰.۰۱٪، جهش قابل شناسایی نیست و زمانی که فراوانی واریانت به ۰.۱٪ می‌رسد، تنها با خوانش به عمق ۱۰،۰۰۰ به طور حتمی قابل تشخیص است. نکته‌ی قابل توجه افزایش هزینه‌ی توالی‌یابی با افزایش عمق خوانش است که عملاً عمق‌های بالا از نظر اقتصادی قابل انجام نخواهندبود۲.
شکل ۵: احتمال تشخیص واریانت جهش‌یافته در درصدهای متفاوت آن در عمق‌های مختلف توالی‌یابی۲
به طور کلی از علاوه بر تغییرات ژنتیکی، تغییرات اپی‌ژنتیکی نیز در نمونه‌های ctDNA قابل بررسی هستند. همان طور که شکل ۶ نشان می‌دهد، تغییرات ژنتیکی شامل جهش‌های ژنتیکی و تغییر در تعداد کپی‌ها و تغییرات اپی‌ژنتیکی شامل الگوی متیلاسیون و جایگاه نوکلئوزوم‌ها از نمونه‌های cfDNA قابل استخراج هستند. بر اساس جایگاه نوکئوزوم‌ها که از طول قطعات به دست می‌آید، می‌توان بیان ژن‌ها استنباط کرد۲.
شکل ۶: تغییرات اپی‌ژنتیکی و ژنتیک قابل بررسی از نمونه‌ی cfDNA۲
کاربردهای بالینی cfDNA
نخستین کاربری استفاده از بیوپسی مایع مربوط به تست‌های غیرهجومی والدین (noninvasive parental testing یا NIPT) برای شناسایی ناهنجاری‌های کروموزمی در جنین بود. در سال ۱۹۹۷ وجود DNA جنین در خون مادر شناسایی شد و مطالعات بعدی نشان داد که بین ۱۰ تا ۱۵ درصد cfDNA خون مادر از جنین نشأت می‌گیرد. بنابراین با شناسایی این کروموزم‌های ترشح‌شده از جنین به داخل خون مادر می‌توان ناهنجاری‌های کروموزومی مربوط به کروموزوم‌های غیرجنسی را شناسایی کرد. در سال ۲۰۱۱ در یک جنین دچار سندروم داون (Down syndrome) ، تریزومی کروموزوم ۲۱ از این طریق شناسایی شد. بعد از آن تریزومی‌های کروموزم‌های ۱۳ و ۱۸ نیز به این شیوه شناسایی شدند و به این ترتیب سه ناهنجاری رایج کروموزومی در کودکانی که زنده به دنیا می‌آیند به کمک cfDNA قابل شناسایی هستند. اگر چه تریزومی‌های ۲۱، ۱۳ و ۱۸ با دقت نسبتاً بالایی (به ترتیب بیش از ۹۵٪، ۸۷٪ و ۷۷٪) صورت می‌گیرد، تشخیص سایر اختلالات ژنتیکی در جنین به این سادگی قابل انجام نیست۱. به دنبال پیشرفت‌های این حوزه، استفاده از ctDNA برای تست‌های تشخیصی سرطان مورد استفاده قرار گرفت و کیت‌های زیادی توسعه یافت که در ادامه به بررسی برخی از آن‌ها می‌پردازیم.
کیت‌های تجاری موجود بر پایه‌ی qPCR
Qiagen therascreen EGFR RGQ PCR kit
این کیت در سال ۲۰۱۵ تأییدیه‌ی خود را از EMA (European Medicines Agency) دریافت کرد. این کیت مبتنی بر qPCR است که می‌تواند جهش‌های متعددی را در ژن EGFR از نمونه‌ی خونی فرد مبتلا به سرطان سینه تشخیص دهد و بر این اساس مناسب بودن درمان‌های tyrosine kinase inhibitor therapies از قبیل gefitinib و afatinib برای فرد تعیین می‌شود. در شکل ۷ ورژن دوم این کیت نشان داده‌شده‌است۷.
Roche cobas® EGFR Mutation Test v2
این کیت نیز بسیار مشابه کیت Qiagen therascreen EGFR RGQ PCR است که در سال ۲۰۱۶ تأییدیه‌ی FDA را به دست آورده‌است۸.
این کیت شرکت کیاژن که مبتنی بر qPCR است می‌تواند با DNA استخراج‌شده از بافت پارافینه‌ی تثبیت‌شده با فرمالین (FFPE) از تومور سرطان سینه‌ی یا ctDNA موجود در نمونه‌ی خونی وجود جهش در ژن PIK3CA را تشخیص دهد. این کیت تأییدیه‌ی FDA را دارد (FDA PMA P190004) و می‌تواند تعیین کند که مناسب بودن تجویز PIQRAY® (alpelisib) برای درمان فرد را تعیین کند۹.
کیت‌های مبتی بر qPCR از ctDNA درصد بالایی از نتایج منفی کاذب (false negative) دارند زیرا برای تشخیص جهش‌های موجود، باید درصد الل‌های جهش‌یافته بیشتر از ۱٪ باشد. به همین خاطر از این تست زمانی استفاده می‌شود که مقدار بیوپسی از بافت توموری کافی نباشد. همچنین اگر نتیجه‌ی این تست منفی شد نیاز است تا با نمونه‌گیری از بافت تومور جواب قطعی مشخص شود۱.
®Epi proColon
شکل ۹: اتصال اختصاصی الیگونوکئیوتیدهای بلاک‌کننده و نشانگرها به DNA الگو۱۲
همچنین کیت‌های qPCR بر پایه‌ی ctDNA به غیر از شناسایی جهش‌ها، برای شناسایی مارکرهای متیلاسیون نیز توسعه یافته‌اند اما این کیت‌ها در یک واکنش حداکثر توانایی تشخیص تغییرات متیلاسیون در۳ تا ۴ ناحیه‌ی ژنی را دارند و بنابراین برای زمانی که مقدار نمونه‌ی کافی از cfDNA در دسترس باشد مناسب هستند۱. Epi proColon کیتی است بر این اساس که تأییدیه‌ی FDA، EMA و CFDA (سازمان غذا و داروی چین) را دارد و برای تشخیص سرطان روده‌ی بزرگ می‌تواند استفاده شود. در این تست متیلاسیون ناحیه‌ی v2 از پروموتر ژن Sept9 که در سرطان روده‌ی بزرگ گزارش شده‌است بررسی می‌شود۱۰. در این تست ابتدا DNA با بی‌سولفیت تیمار می‌شود و سپس با استفاده از نشانگرها و بلاک‌کننده‌های الیگونوکلئوتیدی حساس به متیلاسیون می‌توان توالی‌های متیله را تکثیر و شناسایی کرد۱۱. در شکل ۹ که نشان‌دهنده‌ی نحوه‌ی عملکرد این تست است، دایره‌های مشکی و دایره‌های سفید به ترتیب نشان‌دهنده‌ی توالی‌های متیله و توالی‌های غیرمتیله است که با بی‌سولفیت تیمار شده‌اند. در توالی متیله، نشان‌گر متصل می‌شود اما بلاک‌کننده‌ی جایگاه اتصال پرایمر نمی‌تواند اتصال یابد و بدین ترتیب رشته تکثیر و شناسایی می‌شود (قسمتA). در زمانی که توالی متیله نباشد برعکس آن رخ می‌دهد، یعنی بلاک‌کننده به جایگاه اتصال پرایمر متصل می‌شود و از اتصال پرایمر و تکثیر ژن جلوگیری می‌کند ولی نشان‌گر نمی‌تواند اتصال یابد (قسمت B)۱۲.
کیت‌های تجاری موجود بر پایه‌ی digital PCR
Digital PCR (dPCR) فناوری جدیدی است که همان محتوای qPCR را به کمک نانوفلوئیدیکس در هزاران چاهک مجزا برای انجام PCR به صورت جداگانه تقسیم می‌کند و بعد از انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، از آن تصویربرداری فلوئورسنت می‌شود. به کمک این فناوری می‌توان مقادیر بسیار کم از توالی مورد بررسی در نمونه را شناسایی کرد و جهش‌ها و تغییرات ژنتیکی که مقداری کمتر از ۰.۰۱٪ دارند را در نمونه تشخیص داد، به همین دلیل کاربرد آن برای شناسایی جهش‌ها در نمونه‌های بیوپسی مایع که غلظتی پایین دارند، بسیار جذاب است. Droplet Digital PCR (ddPCR) نیز نوعی dPCR است که در آن که تقسیم‌بندی نمونه به صورت قطراتی در مایعی نامحلول در آب صورت می‌گیرد. سپس در این قطرات واکنش زنجیره‌ای پلیمراز انجام می‌شود و نتیجه‌ی تست به کمک فلوسایتومتری مشخص می‌شود. نقطه‌ی ضعف اصلی dPCR این است که تنها تعداد کمی جهش را در یک واکنش می‌تواند شناسایی کند۱. شکل ۱۰ مقایسه‌ای از انواع تکنیک‌های PCR را ارائه می‌دهد۱۳.
شکل ۱۰: مقایسه‌ای از PCR، qPCR و dPCR ۱۳
BioRad به عنوان یکی از پیشتازان این حوزه، تست‌هایی را برای شناسایی تنوع در تعداد کپی (copy number variation) و جهش‌های تک نوکلئوتیدی از cfDNA و بر پایه‌ی dPCR توسعه داده‌است. شکل ۱۱ به عنوان مثال نتیجه‌ی یکی از تست‌های این شرکت را نشان می‌دهد که تعداد کپی چند ژن را در نمونه‌ی مورد نظر به دست آورده‌است۱۴. شرکت ThermoFisher Scientific نیز تست‌هایی مشابه طراحی کرده‌است که بر اساس آن‌ها بیش از ۱۰۰ جهش رایج در سرطان‌ها را می‌تواند شناسایی کند۱۵.
شکل ۱۱: نمودار به دست آمده مربوط به تعداد کپی از چند ژن در یک نمونه با استفاده از تست بر پایه‌ی dPCR شرکت BioRad۱۴
کیت‌های تجاری موجود بر پایه‌ی توالی‌یابی‌های نسل جدید
مزیت اصلی توالی‌یابی‌های نسل جدید برای تشخیص بیماری امکان شناسایی چندین جهش به صورت هم‌زمان در یک نمونه‌ی فرد بیمار است. حساسیت این روش‌ها تا ۱% است اما با استفاده از شناسه‌های مولکولی یکتا (unique molecular identifier یا UMI) می‌توان این حساسیت را تا ۰.۰۱٪ کاهش داد. UMI در واقع تگ‌هایی هستند که به رشته‌ی نوکلئیک اسیدی متصل می‌شوند تا انحراف ایجادشده به علت PCR در مرحله‌ی آماده‌سازی نمونه‌ها را از بین ببرند. به این ترتیب که با اضافه شدن این تگ‌ها ابتدای توالی، می‌توان توالی‌های یکسانی که حاصل از یک الگوی اولیه بودند را از توالی‌های یکسان که از الگوی متفاوتی ایجاد شدند را شناسایی کرد. بدین ترتیب تکثیرهای متفاوت در فرآیند PCR خنثی می‌شود و همچنین جهش‌های ایجاد شده در این فرآیند قابل شناسایی خواهندبود (شکل۱۲)۱۶. با این حال برای شناسایی جهش‌هایی با کمتر از ۰.۱٪ فراوانی، نیاز است تا توالی‌یابی تا عمق خوانش ۱۰،۰۰۰۰ صورت پذیرد که هزینه‌ی بسیار بالایی را به دنبال دارد. چالش اصلی استفاده از NGS هزینه‌ی بالای هزینه و زمان‌بری زیاد است که کاربرد آن را محدود می‌کند۱.
شکل ۱۲: استفاده از UMIدر PCR ۱۶
تعدادی کیت برای آزمایش‌های بر پایه‌ی cfDNA و NGS موجود هستند که در ادامه توضیح داده می‌شوند.
Oncomine™ cfDNA assay
این تست‌های شرکت ThermoFisher Scientific می‌تواند indelهای کوتاه و SNVهایی که در سرطان ریه، سینه و روده‌ی بزرگ بسیار رواج دارند را از ctDNAهای موجود در نمونه‌ی خون بیمار شناسایی کند۱۷. همچنین Oncomine PanCancer Cell-Free Assay تست دیگر این شرکت بر پایه‌ی cfDNA و cfRNA است و تنها با ۲۰ نانوگرم از آن‌ها می‌تواند CNVها، و SNVها و فیوژن ژن‌ها را با محدودیت شناسایی (limit of detection یا LOD) بسیار پایین تشخیص دهد۱۸.
AVENIO ctDNA Targeted Kit
این کیت شرکت Roche که توانایی شناسایی جهش در ۱۷ ژن و ۴ نوع از جهش‌ها (CNV، SNV، indel و فیوژن) را دارد و به طور خاص برای شناسایی سرطان‌های ریه و روده‌ی بزرگ بهینه شده‌است۱۹.
TruSight Oncology 500 ctDNA
این کیت شرکت illumina که به تازگی وارد بازار شده‌است، در مجموع Mb 1.94 از توالی‌های DNA را مورد هدف قرار می‌دهد و انواع جهش‌ها را در ۵۲۳ ژن مختلف بررسی می‌کند۲۰.
جمع‌بندی
همان‌طور که گفته‌شد استفاده از cfDNA به عنوان یک بیومارکر در تست‌های تشخیصی متعددی به خصوص در سرطان استفاده می‌شود که در ذیل آمدهاند. شکل ۱۳ نیز استفاده از این تست‌ها به منظور تعیین درمان در مراحل مختلف پیشروی سرطان را نشان می‌دهد۲۱.
شکل ۱۳: تست‌های بر پایه‌ی ctDNA تعیین‌کننده‌ی استراتژی‌های درمانی در فازهای مختلف پیشروی سرطان۲۱
شناسایی زودهنگام بیماری به خصوص سرطان
شناسایی حداقل بیماری باقیمانده (MRD) به منظور پیش‌بینی
امکان بازگشت بیماری در فرد بهبود یافته از سرطان
تصمیم‌گیری برای درمان مناسب
امکان شناسایی نئوآنتی‌ژن‌ها برای ایمنی‌درمانی سرطان
با وجود پیشرفت‌های صورت گرفته و بیشتر در دسترس قرار گرفتن فناوری‌هایی مانند NGS، استفاده از cfDNA نیاز به پیشرفت‌های بیشتری است. از جمله مهمترین چالش‌ها در حال حاضر، نیاز به شناسایی جهش‌ها در غلظت‌های پایین از نمونه‌ی جهش یافته است. همچنین با وجود این که مطالعات زیادی در مورد جهش‌های اختصاصی سرطان‌ها انجام شده‌است و اطلس‌هایی مانند TCGA (The Cancer Genome Atlas) به وجود آمدهاند، شناخت بیشتر مارکرهای اختصاصی برای سرطان‌های متعدد ضروری است تا به کمک آن‌ها بتوان وجود سرطان را در افراد در سریعترین زمان ممکن تشخیص داد.
تست‌های برپایه‌ی cfDNA در سال‌های اخیر توسعه‌ی بسیار خوبی یافته‌اند و پیش بینی می‌شود که با پیشرفت فناوری‌های مرتبط در آینده‌ای نه چندان دور هزینه‌های این حوزه کاهش بیابد و برای تست‌های تشخیصی با اهداف مختلف مورد استفاده قرار بگیرند.
منابع
Chen, D., Xu, T., Wang, S., Chang, H., Yu, T., Zhu, Y., & Chen, J. (2020). Liquid Biopsy Applications in the Clinic. Molecular diagnosis & therapy, ۱-۸.
Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E., & Speicher, M. R. (2019). Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nature Reviews Genetics, ۲۰(۲), ۷۱-۸۸.
Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., & Bardelli, A. (2017). Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature reviews Clinical oncology, 14(9), 531-548.
Ramalingam, N., & Jeffrey, S. S. (2018). Future of liquid biopsies with growing technological and bioinformatics studies: opportunities and challenges in discovering tumor heterogeneity with single cell level analysis. Cancer journal (Sudbury, Mass.), 24(2), 104.
Warren, J. D., Xiong, W., Bunker, A. M., Vaughn, C. P., Furtado, L. V., Roberts, W. L., … & Heichman, K. A. (2011). Septin 9 methylated DNA is a sensitive and specific blood test for colorectal cancer. BMC medicine, 9(1), 1-9.
Cottrell, S. E., Distler, J., Goodman, N. S., Mooney, S. H., Kluth, A., Olek, A., … & Berlin, K. (2004). A real‐time PCR assay for DNA‐methylation using methylation‐specific blockers. Nucleic acids research, 32(1), e10-e10.
Zhu, H., Zhang, H., Xu, Y., Laššáková, S., Korabečná, M., & Neužil, P. (2020). PCR past, present and future. BioTechniques, ۶۹(۴), ۳۱۷-۳۲۵.
Pantel, K., & Alix-Panabières, C. (2019). Liquid biopsy and minimal residual disease—latest advances and implications for cure. Nature Reviews Clinical Oncology, ۱۶(۷), ۴۰۹-۴۲۴.
