بوتیریک اسید یک اسید آلی مهم و چهار کربنه با کاربردهای فراوان است. این ماده بیشتر به صورت شیمیایی تولید می‌شود؛ با این حال، توجه عمومی به محصولات طبیعی و سبز در استفاده‌های غذایی، دارویی و دیگر زمینه‌ها، سبب شده است تولید بوتیریک اسید با استفاده از تخمیر مواد اولیه‌ی تجدیدپذیر اهمیت بیشتری پیدا کند.
معرفی بوتیریک اسید
بوتیریک اسید، یک اسید چرب کوتاه زنجیر و فرار با زنجیره‌ی چهار کربن است که کاربردهای فراوانی در صنایع شیمیایی، غذایی، دارویی و خوراک دام دارد. تولید این محصول، بیشتر با روش‌های شیمیایی صورت می‌گیرد و سالانه 80 هزار تن از آن در بازار جهانی به ارزش 144 میلیون دلار فروخته می‌شود. با این وجود، به دلیل توجه مشتریان به محصولات طبیعی، تلاش تولید کنندگان به سمت تولید زیستی این محصول معطوف شده است. پژوهشگران برای تولید زیستی و اقتصادی این محصول، تلاش‌های زیادی برای بهبود میکروارگانیسم‌های تولید کننده‌ی آن و توسعه و کاهش قیمت فرآیندهای تولیدی انجام داده‌اند.
کاربردهای بوتیریک اسید
بوتیریک اسید پرکاربرد در صنایع مختلف است. این ماده با اینکه بوی نامطبوعی دارد، اما در صنایع غذایی برای افزایش بوی‌های کَره از آن استفاده می‌شود. حالت استری آن، مثل متیل، اتیل و آمیل بوتیرات در صنایع عطرسازی برای بهبود رایحه میوه‌ها کاربرد دارد. در صنایع شیمیایی برای تولید ترموپلاستیک‌های نوع سلولوز استات بوتیرات (CAB) از بوتیریک اسید به عنوان پیش‌ماده استفاده می‌کنند. همچنین، از این اسید چرب به عنوان افزودنی در مواد پلیمری یا رشته‌های پارچه برای افزایش مقاومت در برابر حرارت و نور خورشید استفاده می‌شود. برخی از باکتری‌های تولید کننده‌ی سوخت زیستی بوتانول، از این محصول به عنوان پیش‌ماده استفاده می‌کنند.
از بوتیریک اسید برای درمان سرطان روده بزرگ، بیماری‌های معده و روده و همچنین برخی بیماری‌های مربوط به هموگلوبین استفاده می‌شود. گزارش‌های زیادی در مورد خواص زیستی این ماده وجود دارد. به عنوان نمونه، این اسید چرب می‌تواند در بسیاری از سلول‌ها تفکیک ریخت شناسی و زیست-شیمی القا کند که این القا، باعث سرکوب خواص توموری می‌شود. این ماده، همچنین برای فرونشاندن پاسخ‌های التهابی و حساسیت، القای سلول‌های T تنظیمی (Treg) را بهبود می‌دهند. از مشتقات بوتیریک اسید می‌توان برای تولید داروهای ضد تیروئیدی و انقباض عروق و نیز در بی‌هوش کننده‌ها استفاده کرد. علاوه بر این، در خوراک حیوانات، به خصوص حیوانات جوان، از این ماده به جای آنتی بیوتیک‌ها استفاده می‌شود.
تولید فعلی و نیاز آینده به بوتیریک اسید
امروزه بوتیریک اسید از پروپیلن حاصل از پتروشیمی‌ها تولید می‌شود. پروپیلن ارزان و در دسترس بوده و می‌توان به راحتی با هیدروفرمیل‌دار کردن آن (فرآیند تولید آلدهید از آلکن) و با استفاده از گازسنتز در حضور کاتالیست، بوتیریک اسید را با بازدهی 90 درصد تولید کرد. تولید محصول جانبی و نیز ایجاد مواد سمی از جمله معایب این روش محسوب می‌شود. در پژوهش‌های جدیدتر، روش‌های بهتری برای تولید شیمیایی این ماده و کاهش اثرات زیست محیطی این فرآیند ارائه شده است.
تمایل مصرف کنندگان به مواد طبیعی و نگرانی‌های مربوط به تولید مواد نفتی باعث شده است که تولید زیستی بوتیریک اسید از منابع گیاهی و با استفاده از تخمیر میکروبی مورد توجه پژوهشگران قرار گیرد. با وجود تلاش‌های فراوان، تولید زیستی در مقیاس صنعتی به خاطر بازدهی پایین فرآیندهای زیستی و چالش‌های مربوط به جداسازی آن از استیک اسید (یک محصول جانبی) اجرایی نشده است. در همین راستا، پژوهش‌های متنوعی در زمینه مهندسی سویه و بهبود فرآیند زیستی برای تولید این اسید چرب وجود دارد.
سنتز زیستی بوتیریک اسید
بسیاری از باکتری‌های جنس کلوستریدیوم، بوتیری ویبریو و بوتیری باکتریوم می‌توانند بوتیریک اسید را به عنوان محصول اصلی در تخمیر خود تولید کنند. در این بین، جنس کلوستریدیوم که یک باکتری بی‌هوازی است، با مصرف موادی مثل گلوکز، زایلوز، لاکتوز و گلیسرول می‌تواند به مقدار قابل توجهی بوتیریک اسید با بازدهی بالا تولید کند.
بسیاری از گونه‌های غیر بیماری‌زا از این باکتری، توالی ژنوم شناخته شده دارند که برای تولید صنعتی بوتیریک اسید مورد مطالعه قرار گرفته‌اند. بیشترین مطالعات روی کلوستریدیوم تیروبوتیریکوم انجام گرفته است. برخی از سویه‌های این گونه، مثل سویه ATCC 25755 بیشترین مقدار تولید (86/9 گرم بر لیتر) را تا به امروز از خود نشان داده‌اند. ایراد این سویه‌ها این است که نمی‌توانند پلی‌ساکاریدها و یا حتی دی‌ساکاریدها را مصرف کنند.
گونه‌های دیگر کلوستریدیوم که قادرند پلی‌ساکاریدها و گلیسرول را مصرف کنند، یا تولید بوتیریک اسید بسیار پایینی دارند؛ یا اینکه باکتری‌های بیماری‌زا هستند. در این میان، بعضی دیگر از این گونه‌ها مثل کلستریدیوم استوبوتیلیکوم که قادرند بوتیرات و استات تولید کنند، با دستکاری ژنتیکی در آن‌ها می‌توان بوتیریک اسید را با غلظت و بازدهی بالا تولید کرد. در برخی از گونه‌های کلوستریدیوم سلولوز و لیگنوسلولوز مصرف شده و مستقیم به بوتیرات تبدیل می‌شود. با استفاده از این گونه‌ها می‌توان هزینه‌های تولید محصولات را کاهش داد. در ادامه توضیحات بیشتری برای تولید زیستی این محصول ارائه می‌شود.
مسیر سوخت و ساز بوتیریک اسید در باکتری کلوستریدیوم
تقریباً تمام باکتری‌هایی که به صورت طبیعی بوتیریک اسید تولید می‌کنند، هتروتروف هستند؛ یعنی برای رشد و تولید محصول از مواد آلی مثل گلوکوز استفاده می‌کنند. محصولی که در مسیر سنتزی EMP بعد از مصرف گلوکوز تولید می‌شود، پیروویک اسید و سپس استیل کوآنزیم‌آ است. استیل کوآنزیم‌آ از دو مسیر متفاوت می‌تواند به استات یا بوتیریل کوآنزیم‌آ (و در نهایت بوتیرات) تبدیل شود.
مسیر سوخت و ساز در بیشتر گونه‌های کلوستریدیوم تولید بوتیرات است. در بیشتر سویه‌های صنعتی کلوستریدیوم، کوآنزیم‌آ با استفاده از آنزیم کوآنزیم‌آ ترانسفراز از بوتیریل کوآنزیم‌آ به استات منتقل شده و استیل کوآنزیم‌آ تشکیل می‌شود؛ به این ترتیب، استیل کوآنزیم‌آ دوباره برای تولید بوتیرات بکار می‌رود.
عوامل مؤثر بر تخمیر بوتیریک اسید
در تولید بوتیریک اسید و همچنین بازدهی فرآیند تخمیر عواملی مثل پی‌هاش، منبع کربنی، فشار جزئی گاز هیدروژن و برخی عوامل دیگر تأثیرگذار هستند. پی‌هاش روی رشد سلول، غلظت محصول نهایی و نسبت تولید بوتیریک اسید به استیک اسید تأثیر می‌گذارد. معمولاً در تولید این اسید چرب، پی‌هاش بالای عدد شش تنظیم می‌شود. در پی‌هاش‌های پایین‌تر، تولید دیگر اسید‌ها غلبه دارد.
منبع کربنی عامل مهمی در رشد سلول و تولید بوتیریک اسید به شمار می‌رود. به عنوان نمونه، استفاده از پیرووات به جای گلوکوز به عنوان منبع کربنی برای باکتری کلستریدیوم ترموبوتیریکوم باعث می‌شود نسبت وزنی تولید بوتیریک اسید به استیک اسید از 10/5 به 1/1 کاهش یابد. مشابه این مورد برای کلستریدیوم بوتیریکوم زمانی اتفاق می‌افتد که به جای گلوکز از گلیسرول در کشت باکتری استفاده می‌شود.
با افزایش فشار جزئی هیدروژن، نسبت تولید بوتیریک اسید به استیک اسید کاهش می‌یابد. افزودن بنزیل ویولوژن (benzyl viologen) که به عنوان یک حامل مصنوعی الکترون عمل می‌کند، با جلوگیری از تولید هیدروژن، تولید بوتیرات را در کلوستریدیوم تیروبوتیریکوم افزایش می‌دهد. به این ترتیب در کشت منقطع می‌توان بوتیرات با خلوص 98/3 درصد تولید کرد.
حضور بوتیریک اسید و استیک اسید نیز بر تولید محصول اثر می‌گذارد. با اینکه استات محصول فرعی در تولید این محصول است، اما افزودن مقداری استات در کشت باعث افزایش رشد سلولی و تولید بوتیریک اسید می‌شود. همچنین شکل تفکیک نشده بوتیریک اسید یک عامل بازدارنده برای رشد سلول است؛ به صورتی که در برخی از گونه‌های کلوستریدیوم، مقدار 10 گرم بر لیتر از این اسید چرب می‌تواند رشد ویژه سلول‌ها را تا 90 درصد کاهش دهد. به همین دلیل تلاش‌های زیادی برای مقاوم سازی سلول‌ها نسبت به بازدارندگی بوتیریک اسید از طریق تکامل تطبیقی انجام گرفته است.
مهندسی سویه برای تولید بوتیریک اسید
مهم‌ترین چالش در تولید زیستی بوتیریک اسید بازدهی و بهره‌وری پایین محصول است. این چالش به خاطر تولید فرعی استیک اسید و کربن‌دی‌اکسید در کنار محصول اصلی ایجاد می‌شود؛ علاوه بر این، حضور بازدارنده‌ی بوتیریک اسید در کشت برای رشد سلول‌ها حالت بازدارندگی ایجاد می‌کند. بنابراین، ایجاد سویه‌های باکتری با بازدهی بالا و مقاومت نسبت به بوتیریک اسید لازمه تولید اقتصادی این محصول از روش‌های زیستی است.
مهندسی متابولیک کلوستریدیا برای تولید بوتیریک اسید
توالی کامل ژنوم اطلاعات ژنتیکی را برای فهم کامل مسیرهای متابولیکی در تولید بوتیریک اسید فراهم می‌کند. تا به امروز، برای بیش از 10 گونه از باکتری‌های کلوستریدیا، توالی و تفسیر کامل ژنوم انجام شده است. با اینکه ناقل‌های کلونینگ (cloning vectors) متعددی بر اساس تکرار‌های G(+) برای گونه‌های مختلف کلوستریدیا وجود داشته و با موفقیت استفاده شده‌اند، اما به خاطر بازدهی پایینِ تبادل محدود شده است.
بازدهی پایین تبادل را می‌توان با کمک باکتری‌هایی مثل اشرشیا کولی بهبود بخشید. در همین راستا رویکردهای سرکوب ژنی برای بهبود ادغام ژنتیکی توسعه یافته است. علاه بر این، در برخی از تلاش‌های صورت گرفته، پژوهشگران از ابزارهای جدیدتری مثل کریسپر cas9 برای اصلاح ژنوم در سویه‌های کلوستریدیا استفاده کرده‌اند.
با مسدود کردن نسبی مسیر سنتز استیک اسید، تولید بوتیریک اسید در سویه‌های کلوستریدیا افزایش می‌یابد. این کار را می‌توان با سرکوب ژن‌های بیان کننده‌ی آنزیم‌های مربوط به مسیر تولید استات (یعنی فسفوترانس استیلاز و استات کیناز) انجام داد. البته این تغییر باعث کاهش رشد سلولی نیز می‌شود.
سرکوب ژن‌های مربوط به بیان آنزیم فسفوترانس بوتیریلاز که نقش مهمی در تولید بوتیریک اسید دارد، تأثیری روی تولید این ماده در باکتری‌های جهش یافته ندارد؛ اما در مقابل، تولید استیک اسید و رشد سلولی را افزایش می‌دهد. بنابراین، لازم است بررسی کاملی روی مسیر سنتز بوتیریک اسید انجام گیرد تا مهندسی متابولیک روی سویه‌های باکتریایی نتایج بهتری از خود نشان دهد.
بیان بیش از اندازه پروتئین‌های شوک حرارتی می‌تواند تولید بوتیریک اسید و استیک اسید را در سلول‌ها افزایش دهد. این پروتئین‌ها در پاسخ به استرس‌های محیطی توسط سلول‌ها تولید می‌شود. groESL یکی از پروتئین‌های شوک حرارتی است که بیان بیش از اندازه آن در کلوستریدیوم تیروبوتیریکوم، تولید بوتیریک اسید و استیک اسید را در کشت منقطع افزایش می‌دهد.
بیان بیش از اندازه آنزیم‌های محدود کننده سرعت در مسیر سنتزی EMP، مثل 6- فسفوفروکتوکیناز و پیرووات کیناز می‌تواند تأثیر مثبتی روی تولید بوتیریک اسید بگذارد؛ به صورتی که بیان بیش از اندازه این دو آنزیم در کلوستریدیوم تیروبوتیریکوم تولید و بهره‌وری این ماده را در مقایسه با گونه وحشی، به ترتیب 38 و 39 درصد افزایش می‌دهد.
مهندسی متابولیک اشرشیا کولی برای تولید بوتیریک اسید
تولید زیستی بوتیریک اسید از باکتری‌های کلوستریدیا نیازمند شرایط کاملا بی‌هوازی است. با توجه به مشکلات مربوط به تأمین شرایط بی‌هوازی در مقیاس صنعتی و همچنین با توجه به چالش‌های مربوط به مهندسی این باکتری‌ها، تلاش‌های جدید برای تولید زیستی این محصول روی مهندسی اشرشیا کولی تمرکز دارد.
در بعضی از پژوهش‌ها، تنها با حذف برخی ژن‌های موجود در اشرشیاکولی، تولید بوتیریک اسید از گلوکوز بدون بیان ژن خارجی میسر شده است. در کنار این کار، با بیان ژن‌های مربوط به تولید این اسید چرب از باکتری‌های کلوستریدیا به اشرشیا کولی می‌توان تولید این محصول را در این باکتری شناخته شده بهبود داد. همچنین، استفاده از داربست‌های مصنوعی برای بهبود کارایی آنزیم‌های خارجی که در اشرشیا کولی بیان شده‌اند، می‌تواند تولید محصول را تا سه برابر افزایش دهد.
بالاترین میزان تولید بوتیریک اسید در اشرشیا کولی مهندسی شده، با استفاده از مسیر سنتز طبیعی اسید چرب در این باکتری بدست آمده است که در شرایط محدودیت فسفر عمل می‌کند. به هر ترتیب، با اینکه تولید محصول در اشرشیا کولی مهندسی شده با خلوص بالایی انجام می‌گیرد، اما غلظت آن بسیار کمتر از تولید با باکتری‌های کلوستریدیا است.
تکامل تطبیفی برای تقویت سویه‌های تولید کننده بوتیریک اسید
برای تقویت سویه‌های تولید کننده‌ی بوتیریک اسید در مقابل شرایط سخت محیطی می‌توان از رویکردهای تکامل تطبیقی استفاده کرد. تثبیت سلولی یکی از مؤثرترین روش‌ها در این رویکرد محسوب می‌شود. با تثبیت باکتری روی بسترهای رشته‌ای در یک راکتور زیستی، سلول‌ها می‌توانند در شکاف‌های مصنوعی موجود در فضای راکتور، توده‌هایی را با شرایط محیطی مساعد برای خود ایجاد و نسبت به تنش‌های محیطی مقاومت کنند.
تثبیت کلوستریدیوم تیروبوتیریکوم در یک راکتور با بستر رشته‌ای سبب شد که بعد از سه ماه کشت باکتری در این شرایط و با ایجاد استرسِ غلظت بالای بوتیریک اسید، این سویه جهش یافته و مقاومت آن نسبت به بازدارندگی بوتیریک اسید تا 2/3 برابر افزایش یابد. همچنین، این سویه‌ها می‌توانند محصول مورد نظر را با غلظتی بیش از دو برابر سویه وحشی تولید کنند. این روند به صورت موفقیت‌آمیز برای افزایش مقاومت سلول‌ها نسبت به غلظت گلوکوز در محیط انجام گرفت.
توسعه فرآیندهای تخمیری برای تولید بوتیریک اسید
تولید بوتیریک اسید با روش‌های مرسوم کشت منقطع با محدودیت در تولید و بهره‌وری مواجه است که فرآیند را از لحاظ اقتصادی با مشکل مواجه می‌کند. بنابراین لازم است کشت باکتری با روش‌های بهتری مثل کشت در راکتورهای تثبیت سلول، روش جداسازی محصول در محل و نیز کشت با استفاده از مواد اولیه ارزان انجام گیرد.
کشت منقطع باعث ایجاد محدودیت و کاهش تولید بوتیریک اسید در فرآیند می‌شود. در کشت‌های منقطع، غلظت ماده خام اولیه و غلظت نهایی محصول برای رشد سلول‌ها حالت بازدارندگی ایجاد می‌کند. بنابراین با استفاده از فرآیندهای نیمه منقطع می‌توان به چالش بازدارندگی مواد اولیه غلبه کرد. با تثبیت سلول و استفاده از فرآیند منقطع می‌توان بهره‌وری و غلظت محصول را تا حد چشم‌گیری افزایش داد. کشت پیوسته به خاطر غلظت پایین محصول و امکان آلودگی برای تولید بوتیریک اسید موفقیت چندانی از خود نشان نمی‌دهد.
استفاده از راکتورهای تثبیت سلول، بهره‌وری و تولید بوتیریک اسید را در فرآیند تخمیر افزایش می‌دهد. مناسب‌ترین راکتورها برای تثبیت سلولی، راکتورهای بستر ثابت (pack-bed) و بستر شناور (fluidized-bed) هستند. راکتورهای غشایی نیز در این زمینه کاربرد فراوانی دارند.
ایجاد یک فرآیند برای جداسازی بوتیریک اسید به صورت بازیابی در محل از سامانه کشت، چالش‌های مربوط به بازدارندگی مواد روی تولید را برطرف کرده و هزینه‌ی فرآیندهای پایین دستی را کاهش می‌دهد. جداسازی محصول را می‌توان با روش‌های استخراج با حلال، جذب و یون‌زدایی الکتریکی انجام داد. در این روش‌ها، ضمن تعیین بهترین روش برای جداسازی اسید چرب مورد نظر، لازم است تاثیر روش جداسازی روی رشد سلول و تولید محصول در نظر گرفته شود. با در نظر گرفتن این موارد می‌توان بوتیریک اسید را با غلظت، بهره‌وری و خلوص بسیار بالا تولید کرد.
برای کاهش هزینه‌های تولید بوتیریک اسید می‌توان از مواد ارزان قیمت مثل پسماندهای لیگنوسلولوزی، ذرت، ملاس نیشکر، آب‌پنیر، گلیسرول خام، لاشه جلبک‌ها و مواد مشابه استفاده کرد. البته این مواد قبل از استفاده نیازمند آماده‌سازی و هیدرولیز هستند که ممکن است هزینه‌های نهایی تولید را افزایش دهد.
فرآیندهای پایین دستی در تولید زیستی بوتیریک اسید
محصول بدست آمده از روش زیستی تولید بوتیریک اسید نیازمند فرآیندهای پایین دستی مثل جداسازی و خالص‌سازی است. محصول نهایی را می‌توان با استفاده از روش‌های استخراج با حلال، جذب و الکترودیالیز از محلول آبی جداسازی کرد.
استخراج با حلال روش مرسوم در فرآیندهای صنعتی برای استخراج اسیدهای کربوکسیلیک است و می‌توان از این روش برای جداسازی بوتیریک اسید استفاده کرد. این روش ساده بوده و قابلیت استفاده در مقیاس صنعتی را دارد. برای استفاده از این روش باید چالش‌های مربوط به ایمنی حلال و جداسازی فازی در نظر گرفته شود.
در روش جذب می‌توان از رزین‌های پلیمری برای جذب بوتیریک اسید استفاده کرد. چالش اصلی برای استفاده از این روش، قیمت بالای زرین، ظرفیت و انتخاب‌پذیری پایین جذب و مصرف انرژی زیاد برای احیای بستر جاذب است. علاوه بر این، حضور یون‌های سولفات و کلرید کارایی جذب بستر را کاهش می‌دهد.
استفاده از الکترودیالیز برای جداسازی بوتیریک اسید از محیط کشت روش بسیار جدیدی است. در این روش با استفاده از یک غشاء تبادل یونی و با اعمال جریان برق، یون‌های منفی از یک غشاء تبال آنیونی عبور می‌کند. محصولی که با این روش جداسازی می‌شود، خلوص مورد نظر را ندارد و معمولاً نیازمند خالص‌سازی بیشتر است. علاوه بر این، مشکلات مربوط به افزایش مقیاس، گرفتگی غشاء، مصرف بالای انرژی و بازدهی پایین از جمله چالش‌های استفاده از این روش برای جداسازی محصول به شمار می‌رود.
تولید بوتیریک اسید از منابع زیستی نیازمند اصلاح میکروارگانیسم‌های تولید کننده و بهبود فرآیندهای تولید و جداسازی است تا بتوان از آن برای جایگزینی با محصول تولید شده به روش پتروشیمی استفاده کرد. علاوه بر این، استفاده از ابزارهای اصلاح ژنتیکی برای مهندسی مسیرهای متابولیکی در میکروارگانیسم‌های کمتر شناخته شده و ایجاد زیست‌پالایشگاه‌های یکپارچه می‌تواند آینده روشنی را برای تولید زیستی بوتیریک اسید ایجاد کند.
این مطلب در دسامبر 2018 در مجله Biotechnology advances منتشر شده است.
☑ نویسنده: Ling Jiang
☑ ترجمه و بازنویسی: یونس عبدالهی مفرد
☑ منبع
