بهبود پایداری حرارتی آنزیم ها با اصلاح ساختار پروتئین
پایداری حرارتی به‌عنوان یک پارامتر مهم در امکان‌سنجی آنزیم‌ها برای کاربردهای صنعتی در نظر گرفته می‌شود. به‌طور کلی، پایداری بالاتر در برابر دما باعث اثربخشی آنزیم در صنعت می‌شود. با این حال، بیشتر آنزیم‌های طبیعی از نظر حرارتی، پایداری کمی دارند بنابراین کاربرد آن‌ها در صنعت محدود می‌شود. اصلاح ساختار پروتئین یک روش مطلوب برای بهبود خواص آنزیم و پایداری حرارتی آن است.
در سال‌های اخیر پیشرفت چشمگیری در مهندسی پروتئین با هدف پایداری حرارتی حاصل شده است. در این مطالعه مرور کلی سیستماتیک در مورد رویکردهای اصلاح ساختار پروتئین برای بهبود مقاومت حرارتی آنزیم در دهه گذشته ارائه داده شده است. رویکردهای اصلاح ساختار از جمله معرفی فعل و انفعالات غیر کووالانسی و پیوندهای کووالانسی، افزایش پرولین و یا کاهش گلایسین، تقویت تعاملات مونومر-مونومر، معرفی سایت‌های گلیکوزیلاسیون و کوتاه‌سازی برجسته شده است.
آنزیم‌ها به‌عنوان کاتالیزورهای ماکرومولکولی بیولوژیکی به‌دلیل دارا بودن ساختار ذاتی بسیار ریز، گزینه‌های جذاب و رقابتی برای جایگزینی با کاتالیزورهای شیمیایی هستند. در سال‌های اخیر، استفاده از آنزیم‌ها در صنعت داروسازی، تولید مواد شیمیایی، سوخت‌های زیستی، مواد غذایی و … افزایش قابل‌توجهی داشته است. دما به‌عنوان یک پارامتر مهم برای سنجش آنزیم‌ها در کاربردهای صنعتی در نظر گرفته می‌شود. در مرحله اول یک آنزیم پایدار در برابر دما می‌تواند در شرایط سخت پردازش شود و قابلیت استفاده مجدد آن وجود دارد که در نتیجه هزینه‌ها را کاهش می‌دهد.
در مرحله دوم، آنزیم‌های پایدار در برابر دما، قادر به فعالیت در دمای کاری بالایی هستند که ممکن است در شرایط شدید فرایندی با آن‌ها روبرو شوند. این عمل به تسریع واکنش‌ها، حلالیت سوبستراها و کاهش خطرات ناشی از آلودگی میکروبی کمک می‌کند. در مرحله سوم در مهندسی پروتئین آنزیم‌ها با پایداری بالاتری از پتانسیل تکاملی بیشتری برخوردار هستند، زیرا می‌توانند ضمن حفظ ساختار ذاتی خود، طیف وسیع‌تری از جهش های مفید را بپذیرند.
پایداری حرارتی ذاتی آنزیم‌ها از نظر ساختاری از پیش تعیین شده است. مطالعات قبلی با ساختار کریستالی پروتئین‌های مزوفیلی و ترموفیلی نشان می‌دهد که رابطه مهمی بین ساختار پروتئین و پایداری در برابر دما وجود دارد. در سطح ساختار اولیه پروتئین‌ها، مقدار زیادی مولکول‌های آب‌گریز وجود دارد و پرولین‌ها در پروتئین‌های ترموفیلیک وجود دارند.
پیوند هیدروژنی نیروی محرک اصلی برای تشکیل عناصر ساختار ثانویه پروتئین مانند a-helix ،b-sheet و turn است که همگی به پایداری ساختاری پروتئین‌ها کمک می‌کنند و به‌طور عمده از ناحیه حلقه پایدارتر هستند. بنابراین بر استحکام پروتئین تأثیر چشمگیری می‌گذارند. تشکیل ساختار پروتئینی سوم عمدتاً بر تعاملات آب‌گریزی و پیوندهای هیدروژنی بین‌مولکولی استوار است. علاوه بر این، پیوندهای دی‌سولفید و پل‌های نمکی برای تثبیت ساختار سوم پروتئین بسیار مهم هستند.
پیوندهای هیدروژنی، پل‌های نمکی و فعل و انفعالات آب‌گریزی نیز در تثبیت ساختار پروتئین چهار واحدی نقش دارند، در حالی که حالت الیگومریزاسیون بالا به‌عنوان یک عامل اصلی برای مقاومت حرارتی پروتئین در نظر گرفته شده است. با توجه به رابطه نزدیک بین ساختار مولکولی پروتئین و پایداری آن، اصلاح ساختاری یک رویکرد معتبر و مؤثر برای بهبود مقاومت حرارتی پروتئین است.
مطابق شکل یک مهندسی پروتئین، از جمله هدایت کردن تکامل، طراحی منطقی و طراحی نیمه عقلانی ابزاری قدرتمند برای اصلاح ساختار آنزیم به منظور بهبود دمای آن‌ها است. تکامل مستقیم به‌عنوان یک راهبرد گسترده برای بهدست آوردن انواع آنزیم برتر از جمله آنزیم‌های مقاوم در برابر دما استفاده می‌شود، به‌ویژه هنگامی که ساختار آنزیم به خوبی مورد بررسی قرار نگرفته است. نگاهی به روابط ساختار و عملکرد مهندسی پروتئین راهی جذاب است تا با به کارگیری بسیاری از ابزارهای محاسباتی (مطابق جدول یک) مقاومت حرارتی آنزیم‌ها را بهبود بخشد.
جدول1: چندین سیستم نرم‌افزاری معروف برای نظارت بر انعطاف‌پذیری یا پیش‌بینی جهش در تثبیت پروتئین
| Input | Description | Software |
| Sequence | Constructing consensus sequence based on .consensus analysis | Consensus Finder |
| – | .Suggesting stabilizing proline mutations | Proline theory |
| Sequence/structure | Predicting site mutations for thermostabilization based on the database ProTherm | I-mutant 2.0 |
| Structure | Analyzing the unstable area according to the free-energy of unfolding and estimating the importance of the interactions contributing to the protein stability | FoldX |
| – | Detection of weak point in enzymes based on known protein structures used Monte Carlo optimization with simulated annealing | Rosetta |
| – | Based on B-factor which reflects the diffusion of atomic electron density can predict the flexibility of protein structure | B-FITTER |
| – | Locating potential mutant sites based by studying protein folding and unfolding in high temperature | Molecular dynamics simulations |
| – | Predicting the effect of mutations on thermostability depend on the solvent accessibility of the mutant residues | PoPMuSiC |
| – | – | Disulfide by design |
| – | Predicting disulfide bonds according to energy, geometry, and disulfide bond in known protein structure | Modeling of disulfide bonds in proteins |
| – | – | SSBOND |
| – | – | BridgeD |
به‌طور کلی، مقاومت حرارتی آنزیم می‌تواند بر اساس درجه حرارت ذوب آن (Tm) یا دوره نیمه‌عمر (t1/2) بیوکاتالیست مشخص شود. پارامتر Tm، که مشخص‌کننده برگشت‌پذیری یا غیرقابل برگشت بودن ساختار دوم یا سوم پروتئین است، به‌عنوان یکی از مهمترین پارامترهای اصلی برای پایداری حرارتی در نظر گرفته شده است. پارامتر t1/2 به معنای مدت زمان لازم برای حفظ نیمی از فعالیت باقیمانده در دمای معین است که نشان‌دهنده پایداری جنبشی یک آنزیم است.
علاوه بر این، درجه حرارتی که در آن نیمه فعالیت باقیمانده پس از x دقیقه (T50 x) حفظ می‌شود، یک شاخص معمول مورد استفاده برای تعیین بی‌اثر سازی وابسته به دمای آن است. همچنین، دمای مطلوب واکنش آنزیمی (Topt) و حداکثر درجه حرارت از منحنی پایداری (Tmax) نیز برای نشان دادن پایداری حرارتی آنزیم‌ها استفاده می‌شوند.
معرفی تعاملات غیر کووالانسی
در ادامه اتصالات و روش‌های مختلفی که می‌تواند در افزایش مقاومت حرارتی پروتئین مؤثر باشد، معرفی می‌شوند. افزودن پیوندهای غیر کووالانسی، معرفی پیوندهای کووالانسی، افزایش پرولین و/یا کاهش گلیسین، تقویت تعامل مونومر-مونومر، معرفی سایت گلیکوزیلاسیون، کوتاه‌سازی و واکنش‌های چرخه‌ای روش‌های کارآمدی هستند که برای افزاش پایداری حرارتی پروتئین مورد استفاده قرار می‌گیرند.
باندهای هیدروژنی
پیوندهای هیدروژنی از فاکتورهای مهم برای تثبیت ساختار ثانویه پروتئین هستند. راهبرد تاشدگی که توسط اکثر پروتئین‌ها انجام می‌شود، تشکیل حداکثر تعداد پیوند هیدروژنی درون مولکولی است. طبق مطالعه ساختارهای کریستالی مشخص شد که آنزیم‌های ترموفیلی پیوندهای هیدروژنی بیشتری نسبت به آنزیم‌های مزوفیل دارند.
مطابق شکل 2a ، امروزه افزایش پیوندهای هیدروژنی روش اصلی اصلاح ساختار برای بهبود مقاومت پروتئین است. تعدادی از نمونه‌های موفق اخیر برای بهبود مقاومت حرارتی پروتئین وجود دارد که با معرفی پیوندهای هیدروژن بهدست می‌آیند. تکامل مستقیم با استفاده از جهش‌زایی تصادفی یک روش معمول برای معرفی پیوندهای هیدروژنی است. برای برخی از هیدرولازهای A/B مانند لیپاز و استراز، تکامل مستقیم رویکرد اصلی برای افزایش چشمگیر ثبات حرارتی پروتئین است.
پل‌های نمکی
پل‌های نمکی (جفت‌های یونی) که معمولاً در سطح پروتئین‌ها قرار می‌گیرند، به‌ویژه در درجه حرارت بالا نقش مهمی در مقاومت حرارتی پروتئین دارند. در مقایسه با همولوگ‌های مزوفیل پروتئین‌های هایپر ترموفیلی اغلب دارای پل‌های نمکی سطحی هستند. مطالعه ساختار کریستالی پروتئین‌های مختلف با Tm مختلف نشان داد که پروتئین‌های مقاوم در برابر گرما ترجیح می‌دهند حاوی پل‌های نمک متراکم‌تر به فعل و انفعالات آب‌گریزی باشند.
محققان ساختار با کیفیت بالای پروتئین‌های مزوفیلی نسبتاً ترموفیلی و بسیار ترموفیلی را با یکدیگر مقایسه کردند. نتایج بهدست آمده با استفاده از روش‌های آماری نشان داد که پل نمک فاکتور مهمتری نسبت به پیوند هیدروژنی در پروتئین‌های بسیار ترموفیلی است. در سال 1988، نیکلسون و همکارانش جهش‌هایی را معرفی کردند که با پل‌های دوقطبی و نمکی مارپیچ در لیزوزیم T4 ارتباط برقرار کرده و منجر به بهبود دمایی پروتیئن‌های جهش یافته می‌شوند.
نوع مهندسی‌شده آنزیم دمای ذوب تقریباً 2 درجه سانتیگراد بالاتر از نوع وحشی خود دارد. در سال 1990، از یک برنامه کامپیوتری به نام PROTEUS برای طراحی پل‌های نمکی مطلوب در subtilisin BPN استفاده شد که منجر به 1.6 درجه سانتیگراد افزایش Tm نسبت به گونه وحشی پروتئین شد. مشابه معرفی پیوندهای هیدروژنی، جهش‌زایی تصادفی یکی از متداول‌ترین روش‌ها برای افزودن پل‌های نمکی در جهت بهبود مقاومت دمایی آنزیم است.
بازسازی توالی اجدادی (ASR) یکی از روش‌های اصلی طراحی پروتئین مبتنی بر توالی است که می‌تواند با جایگزین کردن توالی‌های مدرن با مانده‌های اجدادی، به گونه‌های متفاوت با پایداری حرارتی بالا دست یابد. نگوین و همکارانش بر روی آنزیم آدنیلات کیناز (Adk) تمرکز کردند که پس از تجزیه و تحلیل ساختارهای کریستالی چندین گره مهم در درخت، مشخص شد که چندین پل نمکی منحصر به فرد به‌طور متوالی در طول تکامل به سمت محیط‌های سردتر ناپدید شده و سپس در گونه‌هایی که متعاقباً با سوله‌های گرم سازگار شده‌اند، دوباره ظاهر می‌شوند. باقی‌مانده‌ها که مسئولیت پل نمک در اجداد Adk ANC1 را بر عهده داشتند به موقعیت‌های مربوطه که در Adk از B. subtilis یافت شده بود، جهش یافتند و در نتیجه تأثیر چشمگیر بر پایداری با افزایش 20 درجه سانتیگراد در Tm نشان داده شد که سهم اصلی در مقاومت حرارتی در برابر این پل‌های نمکی را دارد.
به نظر می‌رسد طراحی منطقی مبتنی بر ساختار پل‌های نمکی روی سطح پروتئین یک راهبرد امیدوارکننده برای تقویت دما باشد. با این حال، پیش‌بینی موقعیت‌هایی که منجر به جایگزینی مؤثر باقی‌مانده‌ها برای ایجاد یک پل نمکی مطلوب می‌شوند، کار دشواری است. بنابراین مشخص کردن مکان‌های انعطاف‌پذیر در ساختار پروتئین و جایگزینی با مانده‌ها معمولاً برای معرفی پتانسیل پل‌های نمکی بالقوه استفاده می‌شوند. یک منطقه انعطاف‌پذیر در لیپاز استنوتروفوموناس مالتوفیلی با استفاده از شبیه‌سازی دینامیک مولکولی (MD) مشخص شد.
همانطور که در شکل 2b نشان داده شده است، بر اساس ضریب B، توالی 200-160 انتخاب شد و سپس جهش‌های G165D و F73R برای معرفی پل‌های نمکی به منظور تثبیت ناحیه انعطاف‌پذیر طراحی شدند. جهش حاصل از ترکیب این دو جهش بهبود مقاوتی بیش از 900 برابر را در 50 درجه سانتیگراد نشان داد.
راهبرد طراحی آماری محاسباتی (SCADS) ابزاری برای طراحی پروتئین است که می‌تواند جهش‌های مناسب با قابلیت افزایش مقاومت حرارتی پروتئین بر اساس برهمکنشهای زنجیره جانبی و درجه انرژی محیطی باقی‌مانده‌ها فراهم کند. چارچوب SCADS برای شناسایی جهش‌های احتمالی در توتون 5-epi-aristolochene سنتاز (TEAS) استفاده شد. دوازده باقیمانده با بالاترین انرژی محیطی که بیش از 12 آنگستروم از سوبستراست، انتخاب شدند. پس از جهش‌زایی مدار Tm ماده TEAS از 38 درجه سانتیگراد به 83 درجه سانتیگراد بهبود یافت. همه 12 باقیمانده بالقوه در معرض سطح و یا دفن‌شده عمدتاً در نزدیکی سطح بودند. در مقایسه با نوع وحشی، بیشتر جهش‌های پیش‌بینی شده از نظر محاسباتی منجر به از بین بردن تکه‌های آب‌گریز بر روی سطح پروتئین و معرفی پل‌های نمکی سطح شده‌اند که ثبات جهش TEAS را تا حد زیادی تقویت کرده است.
در میان نمونه‌های طراحی منطقی، معرفی پل‌های نمکی همیشه به ثبات پروتئین منجر نمی‌شود. پل‌های نمکی که در ساختارهای کریستالی مشخص شده‌اند، همیشه برای تثبیت کارایی ندارند. به‌دلیل از بین رفتن و تثبیت گروه‌ها در سطح پروتئین، افزایش انرژی کولبیک با معرفی باقی‌مانده‌ها اغلب برای جبران کردن خسارات موجود ناشی از دست دادن انرژی آزاد گیبس کافی نیست.
معرفی پل‌های نمکی همیشه گزینه مناسبی برای پایداری نیست زیرا ممکن است بعضی اوقات منجر به تثبیت جزئی و یا حتی ناپایدار کننده پروتئین‌ها شود. شکل‌های هندسی خاص باید هنگام طراحی پل‌های نمکی در نظر گرفته شوند، در حالی که جهش‌های غیر منطقی شیمیایی می‌توانند قبل از تأیید آزمایشگاهی فیلتر شوند.
در تحقیقی که توسط لی و همکارانش انجام شده است، روش جدیدی برای طراحی دقیق پل نمکی با استفاده از ترکیبی از ابزارهای شناسایی سایت‌های انعطاف‌پذیر و یک مدل امتیازدهی بر اساس ترکیب هندسی پل‌های نمکی مانند جهت‌یابی، دسترسی به حلال و مکان‌های سازه ثانویه ارائه شده است. مطابق این روش، پل‌های نمکی روی سطح b-گلوکزیداز مزوفیلیک طراحی شده‌اند که باعث افزایش Tm تا 15.7 درجه سانتیگراد می‌شوند.
برهمکنشهای آروماتیک
تعامل آروماتیک نوعی تعامل غیر کووالانسی بین دو حلقه معطر با کمتر از 7 آنگستروم است. این یک مکانیسم مهم برای تثبیت ساختار پروتئین محسوب می‌شود. تعامل آروماتیک که هم ویژگی پیوند هیدروژنی و هم تعامل آب‌گریزی دارد، می‌تواند تعامل الکترواستاتیک واندروالس و تعامل آب‌گریزی را فراهم کند. با این حال، فعل و انفعالات آروماتیک نیاز به جهت‌یابی خاص از دو حلقه آروماتیکی دارد و فعل و انفعالات آروماتیکی معمولاً در شبکه وجود دارد و به خودی خود نیست که منجر به دشواری در طراحی تعاملات آروماتیکی می‌شود و مقالات تحقیقاتی مربوط به آن اندک می‌شود.
برهمکنشهای آب‌گریز
تعامل آب‌گریز نقش مهمی در تاشدگی پروتئین و تثبیت ساختار سوم پروتئین بازی می‌کند. فعل و انفعالات بیشتر برهمکنشهای آب‌گریزی معمولاً منجر به کندتر شدن سرعت آشکار شدن پروتئین در دمای بالا می‌شود، زیرا تعامل آب‌گریزی می‌تواند با افزایش دما پایدار یا قوی‌تر شود. معرفی تعامل آب‌گریزی برای اولین بار توسط ایمانکا و همکارانش برای افزایش آب‌گریزی داخلی در جهت افزایش مقاومت بسته‌بندی‌های داخلی به‌عنوان یک روش جدید برای مقاومت حرارتی پروتئاز اثبات شد. سپس تعداد زیادی از گزارشات اولیه اثر تثبیت‌کننده جهش‌ها را توضیح دادند که می‌تواند از نظر تأثیرات آب‌گریزی توضیح داده شود.
با استفاده از این روش، کودلاکووا و همکارانش افزایش مقاومت حرارتی برای ساختار سوم پروتئین تا 18 الی 19 درجه سانتیگراد بیشتر در مقایسه با نوع وحشی نشان دادند. مطالعات اخیر نشان می‌دهد که افزایش دما و مقاومت در برابر یک جهش منفرد، به‌ویژه توسط جهش‌زایی تصادفی تولید و سخت‌تر می‌شود زیرا بیشتر آنزیم‌های طبیعی در حال حاضر هسته آب‌گریزی خوبی دارند. این روش از طریق تشخیص رایانه‌ای از نقایص آشکار در هسته‌های آب‌گریز و به‌دنبال آن معرفی باقیماندههای غیر قطبی برای پر کردن حفره یا از بین بردن عوامل ناپایدار توسعه یافته است که یک روش امیدوارکننده برای تولید پروتئین‌های مقاوم در برابر حرارت است.
چارچوب قانونی RosettaVIP بر اساس چارچوب RosettaDesign می‌تواند یک هسته آب‌گریز بسته‌بندی شده از یک پروتئین را مجدداً طراحی کند تا جهش‌های نقطه‌ای را انتخاب کند که می‌تواند تعامل آب‌گریز را برای بهبود کیفیت بسته‌بندی هسته معرفی کند. در مطالعه انجام‌شده توسط بورگو و هاوانک ابتدا از چارچوب RosettaVIP استفاده شد تا به‌طور خودکار جهش‌های تثبیت‌کننده برای متیونین آمینوپپتیداز طراحی شود. پنج جهش (V24I ،C45L ،V207I ،A152I و F156L) منجر به کاهش عمیق در حجم خالی شد که نشان‌دهنده بسته‌بندی بهتر هسته آب‌گریز است. این جهش باعث افزایش Tm تا 17.6 درجه سانتیگراد شد.
همچنین FireProt یک راهبرد محاسباتی قوی است که رویکردهای مبتنی بر انرژی و تکامل را برای پیش‌بینی جهش‌های چند نقطه‌ای بسیار پایدار به‌کار می‌برد. چارچوب FireProt اولین بار توسط بدنار و همکارانش توسعه یافت و با افزایش استحکام حرارتی پروتئین‌های مدل 6 Z. XU ET AL تأیید شده است.
به‌طور سنتی بیشتر باقیماندههای آب‌گریز در قسمت داخلی پروتئین‌ها قرار دارند و جهش‌ها با یک گروه آب‌گریز کاملاً در معرض سطح در بسیاری از چارچوب‌های مهندسی پایداری پروتئین از بین می‌روند. با این حال تحقیقات اخیر حاکی از یک روند جالب توجه است که می‌توان با جایگزینی باقیماندههای قطبی در سطح پروتئین با سطح باقیمانده غیر قطبی، خصوصاً برای باقیمانده Thr در نزدیکی سطح پروتئین، به مقاومت حرارتی پروتئین دست یافت. به‌عنوان مثال، هوانگ و همکارانش تثبیت یک آمین ترانس آمیناز از Aspergillus terreus را توصیف کردند. منطقه G129-D134 که در سطح پروتئین قرار داشت، با توجه به انعطاف‌پذیری بالای آن (تشخیص داده شده توسط B-فاکتور) و انرژی آزاد تاشدگی پروتئین انتخاب شد. پس از جهش‌زایی سایت به‌طور مستقیم، چهار جهش منفرد (T130F ، T130M ، E133F و D134L) از نظر افزایش مقاومت حرارتی بهبود یافتند که در شکل 3 مشاهده می‌شود.
همانطور که گفته شد بقایای قطبی که در سطح پروتئین قرار دارد یا در نزدیکی آن قرار دارد در موارد متعددی از عوامل ناپایدار هستند که به‌دلیل فرایندهای تخریبی ممکن است باعث کاهش انرژی آزاد گیبس از تثبیت پروتئین‌های تاشده شوند. بنابراین در برخی از سطوح انعطاف‌پذیر که برای عملکرد آن بی‌اهمیت است، معرفی چند باقیمانده آب‌گریز ممکن است اثرات غیرمنتظره‌ای بر مقاومت حرارتی پروتئین به همراه آورد.
تعاملات دیگر
پیوندهای دی‌سولفید نقش مهمی در تاشدگی پروتئین و تثبیت ساختار سه‌بعدی دارند. مطالعات متعددی در مورد آنزیم‌های ترموفیلی نشان داد که پیوندهای دی‌سولفید نقش مهمی در پایداری حرارتی دارند. اولین نمونه از مهندسی پیوند دی‌سولفید برای افزایش مقاومت حرارتی پروتئین در سال 1984 توسط پری و وتزل منتشر شد که یک جهش T4 لیزوزیم که باعث ایجاد پیوند دی‌سولفید C3-C97 می‌شود را بهدست آورند و بهبود چشمگیری در پایداری آنزیم در 67 درجه سانتیگراد مشاهده کردند.
برخلاف سایر عوامل ساختاری مهم، باندهای دی‌سولفید را می‌توان به‌راحتی توسط طراحی دی‌سولفید، در سیلیکون طراحی کرد و از آن استفاده کرد. به جز چند نمونه در مورد معرفی باندهای دی‌سولفید با تکامل مستقیم و تراز توالی/ساختار، در طراحی منطقی سیلیکون باندهای دی‌سولفید متداول‌ترین روش استفاده هستند. به‌عنوان مثال اکسیداسیون گروه‌های سولفیدریل آزاد در سیستین و اصلاح ریزگردها (مانند Cu2þ) یکی از دلایل اصلی غیرفعال کردن فرمت دهیدروژناز است.
با این حال اکثر سیستم‌های مهندسی محاسباتی دی‌سولفید وجود تعداد زیادی از باندهای دی‌سولفید را پیش‌بینی می‌کنند، در حالی که فاقد شناسایی کاندیدهای معتبر هستند که ممکن است منجر به ایجاد اثرات منفی شود. مطالعات مختلفی وجود دارد که نشان می‌دهد بعضی از پیوندهای دی‌سولفید تأثیر بسیار کمی در افزایش مقاومت حرارتی پروتئین دارند و حتی می‌توانند پروتئین را ناپایدار کنند. مهندسی باندهای دی‌سولفید در تلاش برای افزایش مقاومت دمایی، ممکن است همیشه به نتایج رضایتبخش منجر نشود. مکان پیوندهای دی‌سولفید و اثرات آن‌ها در مسیر تاشدگی پروتئین‌ها باید در نظر گرفته شود.
امروزه چارچوب بالغ مهندسی دی‌سولفید، تدوین و مورد استفاده گسترده قرار گرفته است. گردش کار این چارچوب شامل (الف): طراحی باندهای دی‌سولفید با روش‌های محاسباتی مانند DbD ،MODIP ،BridgeD. (ب): فیلتر کردن باندهای دی‌سولفید غیر منطقی بر اساس ساختار هندسی (مسافت و زاویه‌های دیافراگم)، انعطاف‌پذیری محلی و موقعیت مکانی (به دور از منطقه عملکردی)، و از بین رفتن باندهای غیر منطقی دی‌سولفید قبل از غربال‌گری آزمایشی (ج): تأیید تشکیل باندهای دی‌سولفید معرفی‌شده با روش المان (د): تجزیه و تحلیل مقاومت حرارتی جهش.
متأسفانه کاربرد اتصالات متقاطع دی‌سولفید مهندسی با محدودیت فاصله مواجه است. علاوه بر این ناپایداری ردوکس پل‌های دی‌سولفید این روش را برای بسیاری از آنزیم‌ها که در کاهش محیط کار می‌کنند، نامناسب می‌کند. معرفی پیوندهای کووالانسی شیمیایی با ثبات با استفاده از اسیدهای آمینه غیر استاندارد (ncAAs) برای افزایش مقاومت حرارتی آنزیم مفید بوده است.
افزایش پرولین و/یا کاهش گلایسین
جهش‌های Gly-Xxx و Xxx-Pro که باعث کاهش آنتروپی آشکار شدن می‌شوند، راهبردهای کلی برای تثبیت پروتئین هستند که برای اولین بار در سال 1987 توسط متیز و همکاران شرح داده شدند. گلیسین دارای بالاترین آنتروپی تطبیقی است و نمایان یک منبع ناپایدار است. جهش Gly به Ala در داخل یک مارپیچ به‌دلیل تمایل بالای مارپیچ و مقدار بالای آنتروپی می‌تواند در مقاومت حرارتی مشارکت داشته باشد. در حالی که پرولین دارای ساختار چرخه‌ای (حلقه پیرولیدین) در زنجیره جانبی است که منجر به استحکام تطبیقی استثنایی آن می‌شود. رویکرد RFS همچنین یک روش عملی برای پیش‌بینی جهش به‌منظور افزایش پرولین و/یا کاهش گلایسین است. تثبیت آنتروپیک با تعویض پرولین یک روش جذاب است که در تثبیت آنزیم‌های سازگار با سرما کاربرد دارد.
به‌دلیل زنجیره جانبی متمایز پرولین، از بین رفتن قابلیت مقاومت حرارتی پروتئین و عملکرد آن نیز در چندین مورد به‌دلیل اختلال در فعل و انفعالات لازم برای حفظ ساختار پروتئین گزارش شده است. بنابراین توصیه می‌شود با توجه به تحلیل ساختاری و آماری، مکان‌های جایگزینی مناسب با اولویت بالا پرولین، مانند موقعیت‌های دوم b-turn و N1 موقعیت a-helices را انتخاب کنید. به‌عنوان مثال، شبیه‌سازی های MD و الگوریتم‌های دینامیک بهینه‌سازی چارچوب B-FITTER برای اولین بار برای شناسایی منطقه انعطاف‌پذیر Photinus pyralis لوسیفراز مورد استفاده قرار گرفت و برای شناسایی یک ساختار b-turn که برای پرولین اولویت دارد از تجزیه و تحلیل ثانویه استفاده شد.
این رویکرد، رویکردهای طراحی منطقی و سنتی را با هم ترکیب کرده است. علاوه بر این، به‌منظور غلبه بر برهم‌کنش های نامطلوب در حالت تاشدگی پروتئین که توسط گلایسین به جایگزینی LAla معرفی شده است، می‌توان از جایگزین‌های Gly به D-Ala در مارپیچ C-capping استفاده کرد تا با کاهش آنتروپی تطبیق‌پذیری، مارپیچ را تثبیت کند. در تحقیقی توسط زو و همکارانش یک الگوریتم سریع برای پیش‌بینی اثرات جایگزینی Gly به D-Ala طراحی شد و برخی از کاندیداهای مطلوب برای جایگزینی D-Ala را در پروتئین Drosophila هومودومین شناسایی کردند. سپس مشاهده کردند که مقدار دامنه Tm در این جایگزینی از 5 الی 9 درجه سانتیگراد بهبود یافته است.
تقویت تعاملات زیر واحدی
سازمان‌دهی پروتئین‌های ساده مونومری توسط پیوند هیدروژنی، پل نمکی و برهم‌کنش متقابل آب‌گریزی برای تشکیل همودیمرها می‌تواند یک ساختار پایدارتر در مقایسه با مونومر ایجاد کند. برخی تحقیقات وضعیت الیگومریزاسیون بالای آنزیم ترموفیلی و سهم تعامل زیرواحد-زیر واحد را در ثبات آنزیم نشان داده‌اند.
تفکیک مونومرها معمولاً اولین قدم برای غیرفعال کردن پروتئین‌های چندتایی محسوب می‌شود. جلوگیری از تفکیک زیر آنزیم برای تثبیت آنزیم‌های چندتایی بسیار مهم است. یکی از متداول‌ترین روش‌های جلوگیری از تفکیک زیر آنزیم‌ها، مهندسی کردن برهم‌کنش های غیر کووالانسی بیشتر برای تقویت قدرت کلی تعاملات زیر واحدی است.
نمونه‌هایی از آنزیم‌های الیگومریک وجود دارد که با معرفی پیوندهای کووالانسی در رابط‌های زیر واحد تثبیت شده‌اند. FRESCO (چارچوبی برای تثبیت سریع آنزیم توسط کتابخانه‌های محاسباتی) یک گردش کاری محاسباتی برای تثبیت آنزیم است که بر اساس محاسبه انرژی‌های تاشدگی پروتئین با الگوریتم‌های متعدد، طرح‌های پیوند دی‌سولفید و در غربال‌گری سریع سیلیکو انجام می‌شود. این روش در اوایل سال 2014 توسط گروه جانسن ارائه شد و در مقاومت حرارتی هیدرولاز لیمونن اپوکسید (LEH) از R. erythropolis DCL14 بررسی شد. علاوه بر پیوندهای دی‌سولفید، لینک‌های شیمیایی زیر واحد-زیر واحد می‌توانند یک راهبرد عملیاتی در دسترس برای ثبات و پایداری پروتئین‌های الیگومریک باشد.
معرفی سایت گلیکوزیلاسیون
گلیکوزیلاسیون یکی از مهمترین اصلاحات پس از ترجمه است. مکانیسم مقاومت حرارتی پروتئین توسط گلیکوزیلاسیون را می‌توان با تثبیت آنتروپیک، آنتالپیک یا جلوگیری از تجمع حرارتی پروتئین توضیح داد. گلیکوزیلاسیون بدون ایجاد تأثیری در برابر تاشدگی و ساختار پروتئین می‌تواند مقاومت حرارتی آنزیم را افزایش دهد، در حالی که حذف محل طبیعی گلیکوزیلاسیون ممکن است به ناپایداری پروتئین منجر شود.
مهندسی گلیکوزیلاسیون یک رویکرد جدید است که در حال حاضر برای بهبود دمای آنزیم‌ها استفاده می‌شود. منطقه‌ای که در آن سایت گلیکوزیلاسیون قرار دارد به‌طور مستقیم مشخص می‌کند که آیا گلیکوزیلاسیون می‌تواند مقاومت حرارتی پروتئین را افزایش دهد یا خیر. تراز توالی و شناسایی سیلیکون پسماندهای حلال قابل‌قبول در منطقه انعطاف‌پذیر، یک ابزار کمکی مشترک برای معرفی آسان گلیکوزیلاسیون است.
شرک و همکارانش کوتیناز AoC و TtC را از Aspergillus oryzae و Thiellavia terrestris که دارای هویت توالی بالا (56 درصد) با یک مدل جنبشی حرارتی کاملاً متفاوت هستند، مقایسه کردند. با مقایسه توالی‌های این دو برش مشاهده کردند که TtC دارای دو سایت گلیکوزیلاسیون، N195 و N123 است که در AoC وجود ندارد و شکل گلیکوزیله آن (TtC-G) با مهار تجمع حرارتی برازیناز، مقاومت حرارتی بهتری دارد. با توجه به تراز توالی، جهش L185N به AoC معرفی شد و یک توالی اجماع (Asn-Gly-Thr) برای گلیکوزیلاسیون ساخته شد. جهش حاصل AoC-G برای مهار تجمع حرارتی کافی بود و بهبود چهار برابری در پایداری جنبشی به دست آمد.
کوتاه‌سازی
حلقه انعطاف‌پذیر و ناپیوسته ترمین در پروتئین‌ها معمولاً جزو عوامل ناپایدار هستند. انعطاف‌پذیری سازگاری این حلقه‌های ناپایدار را می‌توان با کوتاه کردن آن‌ها محدود کرد. در مقایسه با حلقه‌های محکم‌شده توسط فعل و انفعالات غیر کووالانسی یا کووالانسی، حذف حلقه‌ها منجر به پایداری پروتئین می‌شود اما خطر کاهش فعالیت آنزیم و انتخاب را نیز به‌دلیل اهمیت برخی از مناطق حلقه در تعدیل کاتالیز آنزیم، ویژگی، پایداری و فعل و انفعالات پروتئین-پروتئین افزایش می‌دهد.
واکنش چرخه‌ای
مناطق سایت‌های N- و C- معمولاً انعطاف‌پذیرترین قسمت‌های ساختار پروتئین‌ها هستند. به جز محکم‌سازی یا حذف این مناطق ناپایدار، چرخش محل‌های اتصال N- و C- پروتئین‌ها یک روش امیدوارکننده برای تثبیت پروتئین است و ثابت شده است که یک راهبرد عملی برای جلوگیری از مبادله فعالیت و پایداری است.
چرخه سلولی ساختار پروتئین را می‌توان با انعقاد شیمیایی، معرفی پیوندهای دی‌سولفید و انعقاد پپتید بهدست آورد. در میان آن‌ها، معرفی باندهای دی‌سولفید و به‌کارگیری چرخه که دارای مزایای شرایط واکنش مطلوب است، به خوبی در مهندسی پروتئین‌ها برای بهبود پایداری حرارتی در نظر گرفته شده است. واکنش چرخه‌ای SpyRing یک رویکرد مناسب و عمومی برای چرخش پروتئین بر اساس شکل‌گیری پیوند ایزوپپتید است. پس از قرار دادن SpyTag در سایت N- پروتئین و SpyCatcher در Cterminus، پیوند کووالانسی برگشت‌ناپذیر می‌تواند به‌طور خودبخود بین SpyTag و SpyCatcher به‌صورت داخلی رقابت کند.
خلاصه و چشم‌انداز
آنزیم‌های مقاوم در برابر حرارت کاتالیزورهای مفیدی برای انجام فرایندهای سخت صنعتی هستند. مهندسی پروتئین توجه گسترده‌ای را به‌عنوان ابزاری قدرتمند برای افزایش مقاومت حرارتی پروتئین جلب کرده است. افزودن پیوندهای غیر کووالانسی، معرفی پیوندهای کووالانسی، افزایش پرولین و/یا کاهش گلیسین، تقویت تعامل مونومر-مونومر، معرفی سایت گلیکوزیلاسیون، کوتاه‌سازی و واکنش‌های چرخه‌ای روش‌های کارآمدی هستند که برای افزاش پایداری حرارتی پروتئین مورد استفاده قرار می‌گیرند.
در چند سال گذشته افزایش قابل‌توجهی در مقالات منتشر شده در مورد بهبود قابل توجه در دما (افزایش Tm>15) ناشی از اصلاح ساختار پروتئین در دوره سال‌های 2007 الی 2012 مشاهده شده است. همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است، تقریبا 78 درصد از افزایش گزارش شده در Tm کمتر از 15 درجه سانتیگراد بوده، در حالی که تعداد مقالاتی که t1/2 آن‌ها بیشتر از 15 برابر افزایش یافته است 79 درصد از مقالات را شامل می‌شود. این نشان می‌دهد که هنوز پتانسیل بسیار خوبی برای توسعه فناوری‌های مرتبط با مهندسی پروتئین در جهت افزایش مقاومت حرارتی وجود دارد.
با پیشرفت در تبلور پروتئین‌ها، تعداد ساختارهای بیولوژیکی ماکرومولکولی فعال شده در پروتئین‌های موجود در بانک‌های اطلاعاتی PDB) (https://www.rcsb.org به 140،000 عدد رسیده و با سرعتی ثابت این مقدار در حال رشد است. به‌خصوص، تجزیه و تحلیل توالی نوکلئوتیدی و وضوح بالای آن و ساختارهای سه‌بعدی پروتئین‌ها، درک درستی از مقاومت حرارتی پروتئین‌ها را فراهم می‌کند و به طراحی پروتئین‌های مقاوم در برابر حرارت کمک می‌کند. در سال‌های اخیر بسیاری از ابزارهای عالی محاسباتی اعم از تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک از توالی‌های اولیه تا شبیه‌سازی سازه‌های سوم توسعه یافته اند و یک سکوی دستکاری شده را با هدف نظارت بر یک منطقه انعطاف‌پذیر طراحی کرده‌اند و پیش‌بینی جهش‌های مقاوم در برابر حرارت انجام می‌شود.
پیش‌بینی شده است که ایجاد اصلاحات دقیق بر روی پروتئین‌ها با کمک رایانه، اصلی‌ترین نیروی محرکه برای توسعه پایداری حرارتی پروتئین خواهد بود و می‌تواند برای تولید آنزیم‌های پایدار بیشتر برای کاربردهای صنعتی مورد استفاده قرار بگیرند.
