تولید متابولیت های ثانویه گیاهی از کشت‌های سلولی

قرن‌هاست که گیاهان به‌عنوان منابع مواد غذایی، طعم‌دهنده، آکروشیمی و مواد دارویی مورد استفاده قرار می‌گیرند. با این حال زیستگاه‌های طبیعی گیاهان به دلیل تغییرات آب و هوایی و کشاورزی به سرعت از بین می‌روند. بیوتکنولوژی گیاهی یک روش پایدار برای تولید بیولوژیک متابولیت‌های ثانویه گیاهی با استفاده از سیستم‌های آزمایشگاهی ارائه می‌دهد.

ویژگی‌های ساختاری منحصر به فرد متابولیت‌های ثانویه‌ای که گیاهان تولید می‌کنند از جمله مشخصات ایمنی آن‌ها و شباهت متابولیت‌ها منجر به توسعه بسیاری از داروهای گیاهی شده است که شامل تقریباً یک چهارم از تمام داروهای مورد تأیید سازمان غذا و داروی امریکا و یا آژانس دارویی اروپاست. با این حال هنوز چالش‌های بسیاری برای افزایش تولید این متابولیت‌ها در سیستم‌های آزمایشگاهی و ایجاد یک فرایند بیوتکنولوژیکی در مقیاس بزرگ و پایدار وجود دارد.

این چالش‌ها به دلیل ویژگی‌ متابولیسم سلول‌های گیاهی، پیچیدگی مسیرهای متابولیت ثانویه گیاه، انتخاب صحیح سیستم‌های بیوراکتور و بهینه‌سازی فرایندهای زیستی است. در این مطالعه مروری کلی از روش‌های ممکن برای افزایش بیوسنتز مولکول‌های با ارزش موجود در بازار که توسط گیاهان در سیستم‌های آزمایشگاهی قابل تولید هستند، ارائه شده است. این روش‌ها شامل مهندسی متابولیک و فناوری CRISPR/Cas9 برای تنظیم متابولیسم گیاه از طریق بیان بیش از حد و یا سرکوب ژن‌های ساختاری یک یا چندگانه یا فاکتورهای رونویسی است. استفاده از متابولومیکس مبتنی بر NMR برای نظارت بر غلظت متابولیت و علاوه بر این به‌عنوان ابزاری برای مطالعه پویایی متابولیسم سلول‌های گیاهی و مدیریت تغذیه در اینجا مورد بحث قرار گرفته است. انواع مختلفی از سیستم‌های بیوراکتور، اصلاح آن‌ها و پارامترهای بهینه فرآیند برای آزمایشگاه یا تولید در مقیاس صنعتی متابولیت‌های ثانویه گیاه نیز مشخص شده است.

گیاهان به دلیل دارا بودن طیف قابل توجهی از محصولات شیمیایی، به‌ویژه متابولیت‌های ثانویه با فعالیت‌های بیولوژیک مفید برای انسان‌ها، قابل توجه هستند. استفاده یکپارچه از روش‌های مناسب تحلیلی برای غربالگری محصولات طبیعی بهبودیافته در مدل‌های آزمایشگاهی و همچنین مطالعه اهداف مولکولی و شبکه‌‌های مولکول‌های فعال زیستی، منجر به جداسازی چندین داروی ضد سرطان مهم با منشأ گیاهی به‌عنوان مثال پاکلیتاکسل، فسفات اتوپوزید، توپوتکان و همو هارینگتونین شده است. در حال حاضر از بین تعداد زیادی از محصولات طبیعی گیاهی احتمالاً تعداد بسیار بیشتری از این مولکول‌ها در انتظار بهره‌برداری هستند.

متابولیت‌های ثانویه گیاهی دارای چندین ویژگی منحصر به فرد مانند حلقه‌های آروماتیک پیچیده و خاص، مراکز کایرال و نسبتی از هترواتم‌ها هستند که باعث می‌شوند آن‌ها را نه تنها به هدفی برای کشف مواد دارویی بلکه به یک نقطه شروع برای ساخت داروهای جدید تبدیل کنند. در کنار کم بودن یا عدم سمیت و دارا بودن طیف گسترده‌ای از فعالیت یکی دیگر از مزایای مهم داروهای مشتق‌شده از گیاهان شباهت متابولیت آن‌ها به کوچک‌مولکول‌های انسانی است. این بدان معنی است که مولکول‌های طبیعی علاوه بر فعال بودن از نظر بیولوژیکی، هدفی مناسب برای سیستم‌های انتقال هستند که مولکول‌ها را به محل فعالیت خود داخل سلول منتقل می‌کنند. به همین دلیل یک چهارم کلیه داروهایی که اکنون در سازمان غذا و داروی آمریکا (FDA) و آژانس دارویی اروپا (EMA) مورد تأیید قرار گرفته‌اند، مشتق‌شده از گیاهان هستند.

استفاده بسیار از گیاهان و محصولات طبیعی مشتق‌شده از آن‌ها، اختلاف زیادی بین تقاضا و در دسترس بودن آن‌ها ایجاد کرده است. علاوه بر این متابولیت‌های ثانویه گیاهان معمولاً در مقادیر کم موجود هستند و برداشت مواد کافی برای تأمین نیازهای فعلی می‌تواند از نظر زیست محیطی غیرممکن و غیر عملی باشد. در چند دهه اخیر علاقه زیادی به تولید مولکول‌های بیولوژیکی فعال از سیستم‌های آزمایشگاهی مشاهده شده است. این روش‌ها یک دیدگاه جایگزین برای تولید مولکول‌های قابل فروش با ارزش بالا از طریق سیستم‌های مختلف بیوتکنولوژیکی ارائه می‌دهند که مهمترین مزایای آن قوام عملکرد و کیفیت محصولات گیاهی تولیدی، چرخه تولید کوتاه‌تر (در مقایسه با گیاهان کامل)، بهبود ایمنی زیستی (عدم آلودگی محیطی یا ژنتیکی) به دلیل شرایط کنترل‌شده نسبت به روش‌های تولید فعلی است.

هدف از چنین فرآوری زیستی دستیابی به بهره‌وری، بازدهی و غلظت بالای متابولیت‌های ثانویه مورد نظر است. تعداد زیادی از روش‌ها مانند طراحی یک سیستم بیوراکتور مناسب، انتخاب خطوط مولد، بهینه‌سازی محیط مواد مغذی، استخراج، مهندسی متابولیک، کشت دو فازی و تثبیت سلول‌های گیاهی مورد استفاده قرار گرفته است. کشت در مقیاس گسترده با توجه به ویژگی ساختار سلول‌های گیاهی و تنش برشی متوسط ​​تا بالا (تنش برشی بحرانی بین 50 تا 400 نانومتر در مترمربع) محدود شده است. بنابراین بیوراکتور طراحی‌ شده باید از محیط رشد مطلوب، اختلاط کافی، انتقال مؤثر مواد مغذی و تبادل گاز در سطح تنش برشی کم برخوردار باشد.

بهره‌وری گیاه در سیستم‌های آزمایشگاهی می‌تواند با استفاده از رویکردهای مولکولی و مطالعات مدیریت تغذیه بهبود یابد. مهندسی متابولیک به ابزاری قدرتمند برای انتقال ژن‌های جدید به سلول‌های گیاهی مورد استفاده برای تقویت یک مسیر متابولیک مورد نظر، گسترش مسیرهای موجود یا معرفی موارد جدید برای به‌دست آوردن ترکیبات جدید تبدیل شده است. اولین قدم مرسوم شناسایی مراحل محدود‌کننده شدت رشد و به‌دنبال آن بیان بیش از حد و یا سرکوب ژن‌های تنظیم‌کننده آن‌هاست. بنابراین توضیح این مراحل با استفاده از روش‌های multi-omics، بیان همزمان و تجزیه و تحلیل شبکه یکپارچه انجام می‌شود که ارتباط بین ژن‌ها، پروتئین‌ها و متابولیت‌ها را آشکار می‌کند. در عصر ویرایش ژنوم از فناوری CRISPR/Cas9 برای اصلاح ژن‌هایی که در سیستم‌های آزمایشگاهی از مسیرهای بیوسنتزی مهم با هدف تقویت بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه گیاه از طریق جهش‌زایی هدفمند استفاده می‌کنند، استفاده شده است.

متابولومیکس به‌عنوان یک ابزار مفید برای مطالعه مستقیم متابولیت‌ها در نمونه‌های ناهمگن و به‌عنوان بخش اساسی از تکنولوژی‌های امیکس کنونی توسعه یافته است. این برنامه کاربردهای زیادی در علوم از جمله زیست‌شناسی گیاه، سم‌شناسی و تغذیه با هدف شناسایی یک مجموعه متابولیت (تجزیه و تحلیل بی‌هدف) یا اندازه‌گیری متابولیت‌های منتخب (تجزیه و تحلیل هدفمند) یک سلول، بافت یا ارگانیسم دارد. تجزیه و تحلیل گیاه در سیستم‌های آزمایشگاهی با فناوری‌های omics یک مزیت عظیم برای مطالعه فرآیندهای سلولی، عملکرد ژن‌ها و تغییرات شبکه متابولیت‌ها تحت محرک‌های محیطی فراهم می‌کند. این امر منجر به بهینه‌سازی پارامترهای فرایندهای زیستی در طی آزمایشگاه یا مقیاس بزرگ خواهد شد. نمایی جهانی از مباحث تحت پوشش در این بررسی تحت طرح یکپارچه در شکل 1 ارائه شده است.

دستکاری متابولیسم ثانویه از طریق مهندسی متابولیک

طی دهه گذشته احتمال بهره‌برداری از گیاهان در سیستم‌های آزمایشگاهی به‌عنوان “کارخانه سلولی” افزایش یافته است. مهندسی متابولیک از طریق انتقال ژن با گونه‌های آگروباکتریوم و به‌دنبال آن دستکاری مسیر متابولیک گیاهی به‌طور جدی مورد استفاده قرار می‌گیرد تا تولید متابولیت‌های ثانویه گیاهی با ارزش دارویی در سیستم آزمایشگاهی را تقویت کند. بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه توسط شبکه‌های پیچیده تنظیم می‌شود. تنظیم سطح اول به ژن‌های ساختاری از مسیر بیوسنتتیک مورد بررسی بستگی دارد در حالی که تنظیم سطح دوم توسط فاکتورهای رونویسی که بیان ژن‌های ساختاری را کنترل می‌کنند، به دست می‌آید.

در ادامه دو مثال یعنی تنظیم بیوسنتز اسید رزماریک و ترانس رسوراترول مورد بحث قرار می‌گیرد (شکل 2). رزماریک اسید استری است از اسید کافئیک و 3،4-دی‌هیدروکسی فنیلولاتیک اسید که به دلیل داشتن پتانسیل آنتی اکسیدانی و ضد التهابی بسیار مشهور است و بیوسنتز آن در گیاهان مختلف در سیستم‌های آزمایشگاهی مورد توجه قرار گرفته است. ساختار رزماریک اسید دارای دو حلقه 6 جزئی اشباع نشده C1-C6 و ′C1′-C6، یک باند دوگانه در ′C7′-C8، یک گروه استر (′C9)، یک گروه کربوکسیلی (C9) و چهار گروه هیدروکسیل (C3′ ،C4 ،C3 و ′C4) است. همچنین نه گروه CH، یک CH2 و هشت کربن چهارم دارد. مسیرهای بیوسنتزی منتهی به تجمع رزماریک اسید شامل مسیر فنیل پروپانوئید و تیروزین مشتق‌شده است و از اسیدهای آمینه L-فنیل آلانین و L-تیروزین به‌عنوان پیش‌ماده استفاده می‌کند.

توجه بیشتر تحقیقات به فاکتورهای رونویسی برونی مانند MYC2 و bHLH جلب شده است که به تولید اسیدهای فنلیک (مانند رزماریک اسید و لیتوسپرمیک اسید B) کمک می‌کند. مقدار تولید رزماریک اسید تا 2.46 برابر (از 2.59 به 6.36 میلی‌گرم در گرم) و تولید لیتوسپرمیک اسید B تا 1.88 برابر (از 3.17 به 5.95 میلی‌گرم در گرم وزن خشک) افزایش یافته است.

فناوری CRISPR/Cas9: راهی برای ویرایش ژنوم در سیستم‌های آزمایشگاهی 

 به‌طور کلی فناوری CRISPR/Cas9 مبتنی بر مکان‌یابی و شناسایی توالی‌های DNA خارجی توسط RNA‌های کوچک راهنما (gRNA) و شکافتن آن توسط یک endonuclease DNA مرتبط (Cas9) است. فعالیت Cas9 با دو نوع از gRNAها، CRISPR RNA معین و RNA عمل‌کننده مرتبط است. برای افزایش کاربرد این سیستم، به‌ویژه در ویرایش ژنوم سلول یوکاریوتی، دو توالی gRNA جداگانه در یک مولکول RNA راهنما منفرد (sgRNA) ترکیب می‌شوند. ساختار حلقه sgRNA به توالی هدف متصل می‌شود و یک مجموعه با Cas9 ایجاد می‌کند که DNA دو رشته را شکاف می‌دهد و یک شکستگی دو رشته (DNA (DSB را در محل مورد نظر ایجاد می‌کند که توسط سیستم ترمیم سلول میزبان اصلاح می‌شود. پس از تشکیل DSB اصلاح توالی DNA می‌تواند از دو طریق پیوستن انتهای غیرهمولوگ (NHEJ) یا هومولوگ (HDR) اتفاق بیفتد. شکستگی دو رشته معمولاً توسط NHEJ ترمیم می‌شود. این یک فرایند مستعد خطا است که شامل اتصال نوکلئوزید، حذف و اضافه (ایندل) می‌شود و در نتیجه حذفیات، ژن از طریق فرایندهای فرسایش تغییر می‌یابد. در مقابل هنگامی که یک الگوی DNA با بازوهای همولوگ وجود دارد HDR باعث اصلاح دقیق توالی‌های ژنومی می‌شود.

کاربرد عمده فناوری CRISPR/Cas9 در حال حاضر به‌عنوان یک سیستم ویرایش ژنوم است. فناوری ویرایش ژن CRISPR/Cas9 همچنین قادر به ایجاد جهش‌های ارثی و هدفمند در گیاهان می‌باشد.

به منظور نشان دادن کاربرد فناوری CRISPR/Cas9 محققان از کشت یک سلول هویج استفاده کردند. ژن F3H، رمزگذارنده فلاونون-3-هیدروکسیلاز (F3H؛ EC 1.14.11.9) در مسیر آنتوسیانین (بیان یک کالوس هویج به رنگ بنفش) توسط وکتورهای CRISPR/Cas9 مسدود شد. این جهش منجر به رشد کالوس‌های سفیدرنگ شد و کارکرد این ژن و همچنین کارایی نشانگر دیداری برای غربالگری را تأیید کرد.

جهش زایی هدفمند CRISPR/Cas9 تا حد زیادی برای ارزیابی عملکرد ژن‌ها (یا خانواده‌های ژن)، مدیریت مسیرهای مهم بیوسنتزی یا منجر به بهبود محصول استفاده شده است. برخی از کاربردهای اصلی CRISPR/Cas9 در شکل 3 ذکر شده است. کارآیی اصلاح ژنوم با انتخاب یک فنوتیپ برجسته بیان شده در جهش‌های هموزیگوس دنبال می‌شود. این تحقیقات در بسیاری از کشت‌‌های سبزیجات و گیاهان مهم یا ارتباط آن‌ها با سیستم‌های آزمایشگاهی انجام شده است که بیشتر برای به دست آوردن گیاهان تراریخته استفاده می‌شود. 

از فناوری CRISPR/CAS9 برای دستکاری متابولیسم ثانویه گیاه و همچنین تولید پروتئین‌های نوترکیب استفاده شده است. امروزه در مطالعات متابولیسم ثانویه، از فناوری CRISPR/CAS9 عمدتاً برای بررسی پتانسیل بیوسنتتیکی سیستم‌های آزمایشگاهی از طریق خاموش کردن مسیرهای بیوسنتزی رقیب و تغییر نهایی شار متابولیت به سمت تولید ترکیبات هدف استفاده می‌شود.

تولید پروتئین‌های نوترکیب در گیاهان در سیستم آزمایشگاهی دارای مزایای بسیاری در مقایسه با بیوسنتز آن‌ها در کشت‌های میکروبی و پستانداران است، از جمله تاخوردگی صحیح پروتئین‌های پیچیده و اصلاحات پس از ترجمه. با این حال پروتئین‌های تولید شده از گیاهان دارای N-glycans با انتهاهایی است که معمولاً در آن‌ها β(1،2)-xylose در هسته‌ای از α(1،3)-focose قرار دارد که می‌تواند پاسخ ایمنی یا آلرژی را در انسان القا کند.

با وجود پیشرفت بسیار زیاد سیستم ویرایش ژنوم CRISPR/Cas9 هنوز شکاف‌های بسیاری در مورد اثرات خارج از هدف آن در ژنوم گیاه، چگونگی از بین بردن آن و اثربخشی سرعت انتقال جهش بر روی نسل‌های بعدی وجود دارد. مکانیسم تفکیک Cas9 از sgRNA طراحی شده و بازیافت بعدی آن هنوز ناشناخته است بنابراین نیاز به تحقیقات بیشتر دارد. علاوه بر همه این سؤالات سیستم CRISPR نسبت به روش‌های سنتی مهندسی ژنتیک مزایای بسیاری دارد. از آن‌جا که CRISPR/Cas9 از مجتمع‌های ریبونوکلئوپروتئین برای ایجاد DSB استفاده می‌کند طراحی آن‌ها سریع‌تر، آسان‌تر، دقیق‌تر و مقرون به‌صرفه‌تر بوده و امکان ویرایش چندین ژن هدف را به‌طور همزمان فراهم می‌کند. طراحی مجدد ساده sgRNA برای تغییر ویژگی هدف در CRISPR/Cas9 مورد نیاز است، در حالی که در ZFNها و TALENها یک پروتئین جدید اتصال‌دهنده DNA برای هر هدف ژن باید سنتز شود. علاوه بر مزایای ذکر شده سیستم CRISPR/Cas9 در ویرایش ژنوم هدفمند نسبت به سایر فناوری‎ها کارآمدتر است.

تولید متابولیت‌های ثانویه گیاه در بیوراکتورها

افزایش مقیاس کشت گیاه در سیستم‌های آزمایشگاهی به بیوراکتورهایی در مقیاس بزرگ آخرین مرحله از فرایندهای زیستی برای تولید مداوم و پایدار مولکول‌های فعال زیستی کم حجم و با ارزش بالاست. کشت اقتصادی مقرون به‌صرفه در بیوراکتور باید با طراحی بهینه بیوراکتور و انتخاب شرایط عملیاتی بهره‌وری، عملکرد و غلظت بالای متابولیت‌های ثانویه را تضمین کند. همچنین اطمینان از اختلاط کافی (تسهیل انتقال مواد مغذی، جلوگیری از تجمع متابولیت‌های سمی و حفظ تنش برشی کم در محیط)، تبادل گاز (مقدار کافی اکسیژن یا دی‌اکسید کربن برای تنفس) و همگن بودن (جلوگیری از رسوب سلولی) حاصل شود.

طراحی بیوراکتور به اهمیت دارویی و فواید سلامتی متابولیت‌های ثانویه تولیدی برای انسان نیز بستگی دارد. نمونه‌های منتخب تولید رزماریک اسید، رسوراترول و یک مرور کلی در جدول 1 ارائه شده است. هر دو مولکول در طول درمان بیماری عصبی دارای مزایای چندگانه برای سلامتی هستند. بسیاری از بسترهای بیوتکنولوژی رزماریک اسید از جمله سیستم کشت معلق، ساقه یا ریشه از گیاهان مختلف مانند Ocinum basilicum ،Salvia officinalis ،Coleus blumei و Dracocephalum forrestii توسعه یافته‌اند. انواع مختلفی از بیوراکتورها و راهکارهای افزایش تجمع رزماریک اسید مانند مهندسی متابولیک و استخراج با استخراج‌کننده‌های زنده و غیر زنده استفاده شده است. امروزه فناوری کشت تعلیق سلول‌های گیاهی به دلیل الگوی رشد همگن، چرخه‌های تولید کوتاه‌تر و ساخت بیوراکتور ساده‌تر راه را برای تولید متابولیت‌های ثانویه در سطح آزمایشگاهی یا در مقیاس بزرگ فراهم کرده است.

جدول 1. تولید رزماریک اسید و رسوراترول در بیوراکتورهای مختلف

یک محیط با تنش کم در یک بیوراکتور همزن‌دار (مجهز به یک پره پروانه‌ای با سرعت 100 دور در دقیقه) امکان تجمع 30 میلی‌گرم بر گرم وزن خشک رزماریک اسید در طول کشت یک سیستم تعلیق سلول O.basilicum را فراهم کرده است. با این حال به‌عنوان کشت‌های تمایز یافته، سوسپانسیون‌های سلولی با گذشت زمان ناهمگن می‌شوند که منجر به رشد ضعیف و بازدهی کم محصولات طبیعی ناشی از تغییرات ژنتیکی مضر می‌شود. به همین دلیل از کشت ساقه یا ریشه نیز در سیستم آزمایشگاهی برای بیوسنتز رزماریک اسید استفاده شده است. کشت ریشه C.blumei در مقایسه با سیستم تعلیق سلولی تولید پایداری از رزماریک اسید را برای مدت 5 سال ایجاد کرد و ظرفیت بیوسنتز در بیوراکتور هوایی به دلیل فشار کم برشی را تا دو برابر افزایش داد.

یکی دیگر از ساختارهای بیوراکتور که تنش برشی کمی ایجاد می‌کند، بیوراکتور با قابلیت خوراک‌دهی است. محققان ریشه و ساقه‌های S.officinalis را در یک بیوراکتور 5 لیتری با قابلیت خوراک‌دهی کشت دادند. رزماریک اسید انباشته شده در ریشه‌ها 477.13 میلی‌گرم در لیتر بود در حالی که در کشت ساقه‌ای 59.04 میلی‌گرم بر لیتر بود. اثر مشاهده شده با فشار هیدرولیکی بالا ناشی از کشت در پارامترهای انتخابی کشت توضیح داده شد.

یکی از آخرین روندهای افزایش بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه بهره‌برداری از مولکول‌های مختلف سیگنالینگ مانند محرک‌هاست. فقط رژیم کشت در یک بیوراکتور حاوی محرک قادر به دستیابی به حداکثر تولید رزماریک اسید با کشت O. basilicum در یک بیوراکتور همزن‌دار بود. رزماریک اسید انباشته 2.56 برابر بیشتر از کشت بیوراکتور بدون محرک بود. 

گیاهان در سیستم آزمایشگاهی به‌عنوان یک منبع قابل اعتماد تولید متابولیت‌های ثانویه دارویی مرتبط شناخته شده‌اند. با این وجود موفقیت کشت بیوراکتور در مقیاس بزرگ به شرایط کشت و طراحی بیوراکتور بستگی دارد و انتخاب نوع کشت مطابق با محصولات طبیعی تولیدی است. بیوراکتورهای همزن‌دار و فرایندهای خوراک‌دهی با ترکیب مهندسی متابولیک مناسب‌ترین روش برای کشت تعلیقی سلول‌های گیاهی هستند در حالی که کشت ریشه یا ساقه نیاز به استفاده از بیوراکتورهایی مانند بیوراکتورهای هوادهی شده یا قابلیت خوراک‌دهی دارد که تنش برشی کمتری ایجاد می‌کنند. برای دستیابی به رشد بهینه سلول و تشکیل محصول باید پارامترهایی مانند اختلاط و هوادهی بهینه‌سازی شود.

متابولومیکس راهی برای نظارت با وضوح بالا بر متابولیسم ثانویه و رشد سلول در بیوراکتورها

متابولومیکس یک بستر تحلیلی قدرتمند و جامع برای شناسایی و اندازه‌گیری کلیه متابولیت‌ها (اولیه و ثانویه) در یک سلول، بافت یا ارگانیسم است. در کنار سایر فناوری‌های مکمل omics (ترنسکریپتومیکس و پروتئومیکس) متابولومیکس به‌عنوان ابزاری کاربردی برای ارائه‌ی نمای کلی از وضعیت بیوشیمیایی یک ارگانیسم و نظارت بر تغییرات قابل توجه متابولیت به دلایل ژنتیکی یا تغییرات محیطی تکامل یافته است.

مطالعات متابولومیک با استفاده از تجزیه و تحلیل‌های غیر هدفمند (اثر انگشت متابولیت) یا هدفمند (پروفایل متابولیت) انجام می‌شوند، بنابراین نشانگرهای زیستی ژنوتایپیک (پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی) و فنوتایپیک (در رونویسی، پروتئین یا سطح متابولیت) با کاربرد گسترده متابولومیک در زیست‌شناسی گیاهان، علوم غذایی، داروسازی و پزشکی توسعه یافته‌اند.

در علم گیاهان از متابولومیکس برای بررسی تفاوت‌های متابولیت بین گونه‌های گیاهی یا بین اندام‌های مختلف آن‌ها، طبقه‌بندی chemotaxonomic، تشخیص منشأ جغرافیایی گیاهان، کشف مواد دارویی، ارزیابی کیفیت محصولات مشتق‌شده از گیاه، بررسی تغییرات متابولیکی در گیاهان یا گیاهان اصلاح شده ژنتیکی در معرض محرک‌های خاص محیطی استفاده می‌شود.

متابولومیکس مبتنی بر NMR در مقایسه با طیف‌سنجی جرمی (MS) همراه با روش‌های جداسازی مانند کروماتوگرافی گازی GC)/MS)، کروماتوگرافی مایع LC)/MS) کارایی فوق‌العاده بالاتری دارد و در مقایسه با طیف‌سنجی جرمی (UHPLC/MS) دارای چندین مزیت است. NMR یک روش سریع، غیر مخرب و غیر انتخابی برای تشخیص همزمان متابولیت‌های اولیه و ثانویه در عصاره گیاهان پیچیده و بدون نیاز به جداسازی کروماتوگرافی قبلی یا مشتق‌شدن از آنالیت‌ها است. علاوه بر این از طریق تجزیه و تحلیل NMR می‌توان اطلاعات کمی را به‌دست آورد زیرا سیگنال‌های متابولیت‌ها با غلظت مولی آن‌ها متناسب است. محدودیت‌های عمده طیف‌سنجی NMR در مقایسه با MS، حساسیت پایین‌تر (در محدوده میکرومولار به جای پیکومولار برای MS) و همپوشانی سیگنال‌ها در طیف NMR است. این حساسیت می‌تواند با استفاده از آهنرباهای میدان بالا و پروب‌های کرایوژنیک بهبود یابد.

سایر روش‌های تحلیلی با اهمیت شامل مادون قرمز تبدیل فوریه (FT-IR) و طیف‌سنجی مادون قرمز نزدیک (NIR) هستند. هر دو روش غیر مخرب هستند که معمولاً برای اثر انگشت مواد مختلف طبیعی به‌خصوص کنترل کیفیت گیاهان دارویی و برای ارزیابی کیفی سریع آماده‌سازی نمونه در طول متابولومیکس مورد استفاده قرار می‌گیرند. این روش‌ها میزان جذب اشعه مادون قرمز توسط ماده نمونه در مقابل طول موج را اندازه‌گیری می‌کنند. باندهای جذب مادون قرمز با تعیین غلظت گروه‌های عملکردی کلیدی مانند ROH، -SH، C=C، -CH، -OH و NH- اجزا و ساختارهای مولکولی را شناسایی می‌کنند.

پایین بودن میزان بهره‌وری و سطح تولیدپذیری گیاهان در شرایط آزمایشگاهی مهمترین چالشی است که باید برای بهبود رقابت تجاری فرایندهای زیستی سلول‌های گیاهی برطرف شود. مثال‌های موجود تا این مرحله کاربرد متابولیک را برای اندازه‌گیری رشد سلول و غلظت متابولیت‌ها پس از پایان فرآیند ارائه داده‌اند. با این حال غلظت متابولیت تنها وضعیت فعلی یک سیستم متابولیک را نشان می‌دهد. معمولاً پذیرفته شده است که سلول‌های گیاهی از ظرفیت متابولیکی پیچیده‌ای برای انطباق با محیط در حال تغییر برخوردارند که می‌تواند با استفاده از آنالیز شار متابولیک (MFA) و آنالیز کنترل متابولیک (MCA) به‌طور دقیق تجزیه و تحلیل شود. تجزیه و تحلیل شار نشان‌دهنده آنچه که متابولیسم انجام می‌دهد است. شار و میزان گردش نشان‌دهنده رشد سلول، پتانسیل بیوسنتزی متابولیسم اولیه و ثانویه است. بنابراین توصیف جامع از وضعیت فیزیولوژیکی کشت سلولی در مراحل مختلف فرآیند کشت از طریق MFA و وضعیت متابولیک داخل سلولی و خارج سلولی و پیش‌بینی رفتار سیستم کشت ضروری است.

متابولومیکس نزدیکترین بینش را نسبت به یک فرایند فیزیولوژیکی ارائه می‌کند، بنابراین تجزیه و تحلیل یکپارچه از داده‌های بزرگ متابولوم برای مدل‌سازی دقیق متابولیسم و ​​تعیین عوامل منجر به وضعیت فیزیولوژیکی مشاهده شده یا ممکن از کشت سلولی ضروری است. در بیشتر موارد متابولیسم اولیه مرکزی که شامل گلیکولیز، مسیر پنتوز-فسفات (PPP)، چرخه TCA و تجزیه و تحلیل برخی متابولیت‌های اولیه مانند اسیدهای آمینه، اسیدهای آلی، فسفات‌های آلی، لیپیدها و هگزوزهای ساختاری است، مورد بررسی قرار گرفته است.

برخی از مواد مغذی از جمله فسفات معدنی درون سلولی (Pi) به دلیل دارا بودن نقش مهمی که در تنظیم فعالیت‌های آنزیمی از طریق فرآیندهای فسفوریلاسیون/ دفسفوریلاسیون، غلظت شاتل‌های پرانرژی و تعادل (نسبت غلظت ATP/ADP) و توزیع شار بین گلیکولیز و PPP دارند، مورد توجه قرار گرفته‌اند. بنابراین MFA برای درک چگونگی مدیریت مواد مغذی در سلول‌ها ضروری است. این مطالعات نشان داده‌اند که چنین ذخایر درون‌سلولی (به‌عنوان مثال Pi، نیتروژن و قندها) نسبت به بهینه‌سازی محیط کشت که به شکل مرسوم مورد توجه قرار می‌گیرد برای تولید متابولیت‌های ثانویه مهمتر هستند. داده‌های توصیف‌کننده شرایط فیزیولوژیکی، تغذیه‌ای، متابولیکی و رفتار پویای جمعیت سلولی می‌توانند برای مقیاس‌بندی بیشتر فرایند بیوراکتور مورد استفاده قرار بگیرند. همچنین می‌توان زیرشبکه‌های متابولیکی و استخرهای متابولیت را در محفظه‌های خاص سلول تشخیص داد که می‌تواند برای درک و پیش‌بینی تنظیم برخی متابولیت‌های ثانویه مانند TIAها که برای تولید آن بیوسنتز در محفظه‌های مختلف درون سلولی اتفاق می‌افتد، مفید باشد.

به عنوان مثال در تعلیق سلول هتروتروفیک Arabidopsis توزیع مجدد شار متابولیسم مرکزی از طریق آزمایشات برچسب زدن گلوکز با [1-¹³C]- و [U-¹³C₆] دنبال شد. با تمرکز بر روی مسیر PPP مشخص شد که مراحل اکسیداتیو این مسیر در سیتوزول و پلاستیدها دو برابر انجام می‌شود و شار از طریق این واکنش‌ها تا حد زیادی در سیتوزول اتفاق می‌افتد.

نمونه‌ای از طیف‌سنجی NMR که به‌عنوان یک ابزار نظارت در زمان واقعی پارامترهای فیزیولوژیکی از جمله زنده ماندن سلولی و رشد در طول تعلیق سلول‌های گیاهی مورد استفاده قرار می‌گیرد توسط محققان شرح داده شده است. این نویسندگان برای اندازه‌گیری متابولیت‌های مختلف (ساکارز، فروکتوز، گلوکز و میواینوزیتول) یک تراشه میکروسیالی ایجاد کرده‌اند که مطابق با وضعیت رشد سیستم تعلیق سلولی BY-2 توتون و فعالیت متابولیک سلول معلق است. به‌عنوان مثال سطح گلوکز و میواینوزیتول در چهار روز اول کشت بسیار پایین بود که مربوط به تکثیر فشرده است در حالی که بعد از روز پنجم تا پایان روند سطح گلوکز و میواینوزیتول به دلیل کاهش فعالیت کاتابولیک و مرحله تکثیر افزایش یافت.

تحقیقات پویای MFA کاربردهای دیگری را برای ارزیابی و کنترل برخی فرآیندهای مهم در طول کشت بیوراکتور یافته است که به‌طور جدی مانع از کشت در مقیاس بزرگ گیاه در سیستم‌های آزمایشگاهی می‌شوند. به‌عنوان مثال می‌توان به بررسی واکنش‌های تبدیل زیستی (از جمله سم‌زدایی) برخی از متابولیت‌های ثانویه، ارزیابی پتانسیل سمیت سلولی داروها و نظارت بر تغییر پویا در بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه اشاره کرد.

محققان مزایای استفاده از کروماتوگرافی مایع را از نظر ظرفیت پیک بالا، وضوح بالا، حساسیت و اندازه‌گیری دقیق جرم به‌منظور مطالعه تغییرات متابولیسم تاکسوئید در تعلیق سلول T. chinensis در پاسخ به تنش برشی بررسی کردند. این روش 49 متابولیت را شناسایی کرد که 21 مورد آن تاکسوئیدهایی بودند که بیشتر در 8 طبقه قرار گرفتند. تجزیه و تحلیل مؤلفه اصلی (PCA)، تفاوت در میزان متابولیت بین سلول‌های کنترل ‌شده و تحت استرس را نشان داد. تنش برشی منجر به افزایش قابل توجه 10deacetylyunnanaxane شد در حالی که کاهش 9dihydro-13-acetylbaccatin III و 10hydroxyacetylbaccatin VI مشاهده شد.

جداسازی کروماتوگرافی و یک سیستم HPLC-ESI-MS برای تبیین پدیده‌ قهوه‌ای شدن که در طول کشت بیوراکتور T. chinensis و تعلیق سلولی Glycyrrhiza inflata رخ می‌دهد با بررسی پروفایل فاکتورهای رونویسی و ترکیبات قهوه‌ای رنگ، استفاده شده است. مشخص شد که قهوه‎ای شدن در سه روز اول کشت بیوراکتور هنگامی که افزایش تجمع فنلی خارج سلولی، پلی‌فنل‌اکسیداز و ساکارز افزایش می‌یابد، رخ می‌دهد. فلاونوئیدهای شناسایی‌شده (میریستین، daidzen، کوئرستین، نارینژنین، جنستئین و کائمپرفرول) توسط HPLC-MS بر اساس متابولیسم قند مانند ساکارز تنظیم می‌شدند. بنابراین با استفاده از متابولومیکس نه تنها مکانیسم‌های آنزیمی قهوه‌ای شدن توضیح داده می‌شود بلکه رویکردهای کنترل مؤثر روی آن به دست می‌آید. مهار برخی از ژن‌های رمزگذاری کننده آنزیم‌های درگیر در متابولیسم ساکارز و مسیر فنیل‌پروپانوئید با افزودن اسید جیبرلیک (GA3) منجر به کنترل مؤثر قهوه‌ای شدن در هر دو کشت شد. از سیستم NMR پرفیوژن اخیراً برای مطالعه در زمان واقعی واکنش گلیکوزیلیشن scopoletin به scopolin استفاده شده است که باعث بهبود خاصیت ضد التهابی این ماده می‌شود. به دلیل شباهت ساختاری بین این دو متابولیت از سیستم 2D TOCSY و NOESY ¹H NMR استفاده شد. این سیستم حتی برای ارزیابی پتانسیل سمیت سلولی داروها تکامل یافته است.

نتیجه‌گیری و دیدگاه‌های آینده

دانش پیشرفته در مورد شبکه‌های متابولیک پیچیده گیاهی درگیر در بیوسنتز متابولیت‌های فعال مهم و درک عمیق‌تر از سیستم نظارتی که بر متابولیسم ثانویه حاکم است به‌طور بالقوه می‌تواند مهندسی متابولیک مولکول‌های مورد نظر را در سیستم‌های آزمایشگاهی به‌طور موفق انجام دهد. ادغام فناوری‌های omics-ژنومیک، پروتئومیکس، ترنسکریپتومیکس و متابولومیکس برای درک مسیرهای بیوسنتزی گیاه منتهی به تولید متابولیت‌های ثانویه و تعیین چگونگی دستکاری در آن مسیرها مهم است.

به‌طور واضح در نظر گرفتن داده‌های ترنسکریپتوم و متابولوم برای مطالعه شبکه‌های ژن تا متابولیت در متابولیسم ثانویه گیاهان لازم است. این می‌تواند در آشکار ساختن رابطه بین ژن‌ها و ترکیباتی که تولیدشان را کنترل می‌کنند مفید باشد و در نتیجه شناسایی ژن‌های مرتبط با بیوسنتز آن‌ها انجام شود. فناوری CRISPR/Cas9 با هدف تقویت متابولیسم ثانویه گیاه یا شناسایی ژن‌های مهم مسئول افزایش مقاومت در برابر عوامل مختلف زنده یا غیر زنده برای مهندسی ژنوم در بسیاری از سیستم‌های آزمایشگاهی با موفقیت مورد استفاده قرار گرفته است. بنابراین می‌توان فنوتایپ‌های مورد نظر محصولات زراعی یا گیاهان دارویی را در مرحله بسیار اولیه حتی در سطح کالوس انتخاب کرد.

برای به‌دست آوردن بازدهی بالا از متابویت‌های ثانویه مورد نظر در بیوراکتورها استفاده از روش‌های مختلف بهینه‌سازی در پارامترهای فرآیند، بهینه‌سازی محیط کشت، نحوه خوراک‌دهی پیش‌ماده یا استخراج ضروری است. انتخاب ساختار مناسب بیوراکتور کاری پیچیده است. اگرچه تعداد زیادی از بیوراکتورهای قابل استفاده مجدد یا یکبار مصرف در دسترس هستند اما انتخاب ایده‌آل به کشت و مقیاس محصول هدفمند بستگی دارد. برای دستیابی به رشد بهینه و سنتز محصول پارامترهای کشت (به‌ویژه مخلوط کردن و هوادهی) باید دقیقاً متعادل شوند. تاکنون بیشتر کشت‌های کوچک یا بزرگ در بیواکتورهای مخزنی همزن‌دار انجام شده است زیرا این نوع بیوراکتور اختلاط بهینه همگن را تضمین می‌کنند و نیروهای برشی را در حد قابل تحمل نگه می‌دارند.

چالش‌های مختلفی در حین مقیاس‌بندی فرایندهای بیوتکنولوژیکی به دلیل ماهیت خاص گیاه در سیستم‌های آزمایشگاهی و متابولیسم آن‌ها وجود دارد. یک راه‌حل مناسب برای هر دو، مطالعه و کنترل غلظت متابولیت و شار متابولیت در طول کشت بیوراکتور است که می‌تواند به صورت خارج از خط و یا بر خط بر اساس اندازه‌گیری مبتنی بر NMR انجام شود. NMR پتانسیل خود را برای توصیف مستقیم حالت فیزیولوژیکی و متابولیک سلول‌های زنده یا بافت‌ها به روش غیر تهاجمی نشان داده و تغییرات متابولیکی را در پاسخ به تغییرات محیطی دنبال می‌کند.

مطالعه پویایی شار متابولیک می‌تواند رفتار سلولی در طول کشت غوطه‌ور را از نظر قابلیت زنده ماندن سلولی، تقسیم و رشد و همچنین توصیف سینتیک مسیرهای متابولیک اولیه و ثانویه و تنظیم آن‌ها از طریق سطح مواد مغذی داخل سلولی توضیح دهد. توسعه روش‌های مدل‌سازی کارآمد برای مدیریت انرژی در سلول‌های گیاهی و تعدیل مسیرهای متابولیک گیاهی منجر به تولید متابولیت هدف از طریق بهینه‌سازی شرایط رشد، می‌تواند با استفاده از بیوراکتورها به پیشرفت تولید مولکول‌های فعال زیستی مهم کمک کند.