محققان نخستین مهارکننده‌های ریزمولکولی پروتئین (Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9 را کشف کردند که قادرند کنترل دقیق‌تری روی ویرایش ژنوم مبتنی بر CRISPR-Cas9 داشته باشند. با توجه به توسعه ارزیابی‌های بیوشیمیایی با توان بالا و سلول‌محور، محققان مجموعه‌ای از ریزمولکول‌های متنوع را غربالگری کرده‌اند تا ترکیباتی که مختل‌کننده اتصال SpCas9 به DNA هستند را شناسایی کرده و در قابلیت آن‌ها برای شکستن DNA مداخله کنند.
این مهارکننده‌ها اولین مهارکننده‌های ریزمولکولی CRISPR-Cas9 هستند که به راحتی وارد سلول‌ها می‌شوند و بسیار کوچک‌تر از پروتئین‌های ضد CRISPR ای هستند که پیش از این کشف شده‌اند. ترکیبات جدید امکان کنترل برگشت‌پذیر و وابسته به دوز فناوری‌های مبتنی بر SpCas9، از جمله برنامه‌های ویرایش ژن، ویرایش پایه، و ویرایش اپی‌ژنتیکی در سلول‌های پستانداران را فراهم می‌آورند.
این مطالعات، اساسی را برای شناسایی سریع و استفاده از مهارکننده‌های ریزمولکولی علیه SpCas9 و نوکلئازهای مرتبط با CRISPR نسل بعد ایجاد می‌کنند. این مهارکننده‌ها دارای پتانسیل بالقوه برای استفاده وسیع در تحقیقات پایه، پزشکی، و دفاعی و نیز برنامه‌های کاربردی بیوتکنولوژی دارند. در حال حاضر، SpCas9 به عنوان یک عامل ژن‌درمانی برای بیماری‌های مختلف از جمله HIV، اختلالات بینایی، دیستروفی عضلانی و سایر اختلالات وراثتی در حال توسعه است.
این برنامه‌های درمانی از کنترل دقیقی بر دوز و زمان‌بندی فعالیت SpCas9 برای کاهش اثرات خارج از محدوده هدف برخوردار هستند. کنترل این جنبه‌های فعالیت SpCas9 می‌تواند برای برنامه‌های کاربردی دیگر، از قبیل ویرایش کارآمد DNA ارگانیسم‌های مدل برای مدل‌سازی و مطالعه بیماری، و استفاده از راهنماهای ژنی در پشه‌های مهندسی ژنتیک‌شده برای جلوگیری از گسترش مالاریا و سایر بیماری‌های ایجادشده از پشه‌ها، مفید باشد.
نیاز به کنترل دوز و زمان‌بندی SpCas9 تقاضا برای خلق مولکول‌های ضد CRISPR را ایجاد کرده است. اگرچه پروتئین‌های ضد CRISPR که SpCas9 را هدف قرار می‌دهند وجود دارند، اما بزرگ و غیر قابل‌نفوذ به سلول‌ها و غیر قابل‌برگشت در عمل هستند و می‌توانند توسط پروتئازها هضم شوند. هم‌چنین ممکن است خطر واکنش‌های نامطلوب ایمنی در بدن را به همراه داشته باشند. در مقابل، مهارکننده‌های ریزمولکولی از لحاظ پروتئولیتیک، پایدار، برگشت‌پذیر و به طور کلی غیر ایمونوژن هستند و به راحتی می‌توانند از طریق انتشار غیرفعال وارد سلول‌ها شوند. علاوه بر این، آن‌ها را می‌توان در مقیاس بزرگ با هزینه کم و تنوع زیاد سنتز کرد.
در این مطالعه محققان یک پلت‌فرم قدرتمند، حساس و قابل اندازه‌گیری برای شناسایی و اعتبارسنجی سریع و مقرون به صرفه مهارکننده‌های ریزمولکول SpCas9 را معرفی کردند. اندازه‌گیری فعالیت CRISPR-Cas9 با یک روش پرتوان که به دارو امکان غربالگری را دهد، به علت ویژگی‌های آنزیم SpCas9 چالش‌برانگیز است. در این مقاله محققان ارزیابی‌های کامل اولیه و ثانویه را به ترتیب برای اتصال SpCas9-DNA و فعالیت برش‌دهندگی DNA SpCas9 توسعه دادند.
برای ارزیابی اولیه، آن‌ها از یک تکنیک بیوشیمیایی به نام پولاریزاسیون فلوئورسانس برای نظارت بر تعامل بین SpCas9 و یک بخش DNA که توسط فلوئورسانس مشخص می‌شود و حاوی توالی‌های PAM است، استفاده کردند. در ارزیابی ثانویه، از میکروسکوپ خودکار برای اندازه‌گیری تغییرات فلوئورسانس ناشی از شکستن DNA یک ژن گزارش‌گر در سلول‌ها، توسط SpCas9 استفاده شد.
محققان با استفاده از این ارزیابی‌ها، در ابتدا اجزا مشخص‌کننده گروه‌های متعدد ریزمولکول‌ها را برای شناسایی گروهی که اجزای آن اغلب SpCas9 را مهار می‌کرد، تعیین کردند. آن‌ها دو ترکیب اصلی را شناسایی کردند که توانایی SpCas9 برای اتصال به DNA را مختل و شکست DNA به واسطه SpCas9 به طریق وابسته به دوز در سلول‌های پستانداران را مهار می‌کردند.
با این همه، این مولکول‌ها هنوز برای استفاده در انسان‌ها آماده نیستند و برای اثربخشی در ارگانیسم‌ها آزمایش نشده‌اند. یکی از اهداف محققان در مطالعات آینده، شناسایی محل‌های اتصال مهارکننده‌ها روی کمپلکس SpCas9:gRNA، بررسی مکانیسم عمل آن‌ها و بهینه‌سازی توانایی آن‌ها خواهد بود.
