روش‌های تولید فرآورده‌های طبیعی در قارچ‌ها

قارچ‌ها یکی از مهم‌ترین منابع برای تولید ترکیبات فعال زیستی به شمار می‌آیند. برخی از این ترکیبات به‌عنوان دارو استفاده می‌شوند. تعیین توالی‌های ژنومی نشان می‌دهد که قارچ‌ها می‌توانند سهم بیشتری را در تولید فرآورده‌های طبیعی (NP) داشته باشند.

اخیراً دسته‌های ژنی از قارچ‌ها شناسایی شده‌اند که در تولید فرآورده‌های طبیعی دخیل‌اند و بدین‌ ترتیب راه برای انجام آزمایشات مهندسی ژنتیک و تولید ترکیبات دلخواه از این فرآورده‌ها بازتر شده است. این مطالعه به‌طور خلاصه مثال‌هایی از بیوسنتز فرآورده‌های طبیعی در قارچ‌های مهندسی شده را در مسیرهای عمومی تولید بررسی می‌کند. به‌علاوه تعیین سطح آنزیمی در محیط‌های آزمایشگاهی و محیط بدن موجود زنده، مقایسه میزان بیان‌های غیر مشابه، توسعه‌ مسیرهای بیوسنتز ترکیبی، درک چگونگی عمل دسته‌های ژنی دخیل در بیوسنتز و فهم عملکرد آنزیم‌های بیوسنتزکننده‌ جدید به عنوان کاتالیزور نیز مورد مطالعه قرار گرفته است.

فرآورده‌های طبیعی و مشتقات آن‌ها بین سال‌های ۱۹۸۱ تا ۲۰۱۴ سهم ۲۵ درصدی را در تولید داروهای تأییدشده‌ سازمان غذا و داروی آمریکا (FDA) داشته‌اند. قارچ‌ها نیز در تولید داروهایی همچون آنتی‌بیوتیک‌ها مانند پنی‌سیلین و پلوروموتیلین (pleuromutilin)، داروهای کاهنده‌ کلسترول مانند لواستاتین (lovastatin) و کامپاکتین (compactin)، داروهای سرکوب‌کننده‌ ایمنی مانند میکوفنولیک اسید (mycophenolic) و سیکلوسپورین (cyclosporin) نقش مهمی دارند. کارسینوژن (مانند آفلاتوکسین)، توکسین کشنده (مانند آلفا آمانیتین)، قارچ‌کش‌های صنعتی (مانند استروبیلورین)، رنگ‌های غذایی (مانند آزافیلون)، هورمون‌ها (مانند جیبرلین) و مواد روان‌گردان (مانند سیلوسیبین) از جمله مواردی است که فرآورده‌های طبیعی استخراج شده از قارچ‌ها می‌توانند به کار گرفته شوند. این ترکیبات به‌طور طبیعی، قارچ‌ها را در مقابل عوامل محیطی همچون حشرات، اشعه ماوراء بنفش محافظت می‌کند و در رقابت با سایر میکروارگانیسم‌ها برای تصاحب نیچ خود یاری می‌کنند. گستره‌ عملکردی این ترکیبات به ساختارهای متفاوت آن‌ها وابسته است. پلی‌کیتیدها، پپتیدها، ترپن‌ها و آلکالوئیدها، از جمله ساختمان‌های مختلفی است که فرآورده‌های طبیعی قارچی می‌توانند داشته باشند.

فرآیندهای تولید متابولیت‌های ثانویه در قارچ‌ها بسیار پیچیده است. به‌علاوه تولید کم و وابسته به شرایط محیطی این ترکیبات موجب شده است که تولید تجاری و آزمایشگاهی آن‌ها امری دشوار باشد. اما به سبب نقش مهم فرآورده‌های طبیعی قارچی‌ها در صنعت داروسازی، دانشمندان در تلاش‌اند تا مشابه این ترکیبات را تولید کنند؛ یا به‌گونه‌ای مسیرهای بیوسنتزی که خاموش هستند را برای تولید این محصولات فعال کنند. در سال‌های اخیر شیوه‌های جدیدی برای تولید فرآورده‌های طبیعی در قارچ‌های مهندسی شده ارائه شده که در قالب سه گروه قابل دسته‌بندی هستند.

۱- دستکاری در فرایند رونویسی عمومی که بر فعال شدن سازوکارهای بیوسنتزی اثر می‌گذارد. همچنین می‌تواند با تأثیر بر مسیرهای چندگانه موجب تولید انواع متنوعی از فرآورده‌های طبیعی می‌شود. اما این شیوه غیرقابل پیش‌بینی است و کنترل کردن آن به سختی امکان‌پذیر است. برای این‌گونه دستکاری‌ها در فرایند رونویسی تغیبرات اپی‌ژنتیکی و یا بیان بیش از حد تنظیم‌کننده‌های رونویسی انجام می‌شود.
۲- دستکاری مسیرهای بیوسنتزی در میزبان‌های مشابه یا متفاوت. در این روش علاوه بر تعیین هدف می‌توان عملکرد هر ژن و نوع کلاس آنزیم‌ها را نیز شناسایی کرد. این روش بسیار پیچیده است.
۳- یک آنزیم به‌خصوص مهندسی می‌شود تا در پی آن یک فرآورده طبیعی جدید در محیط آزمایشگاهی یا در شرایط بدن موجود زنده تولید شود.

مجموعه‌های ژنی بیوسنتزی (BGCs) قارچ‌ها

تاکنون بیش از ۱۲۰ هزار گونه‌ قارچی شناسایی شده‌ است اما تخمین زده می‌شود تعداد واقعی آن‌ها بین ۲.۳ تا ۳.۸ میلیون عدد باشد. توالی ژنومی ۱۰۰۰ قارچ در دسترس است و البته مکان مجموعه‌های ژنی بیوسنتزکننده (BGCs) آن‌ها نیز مشخص شده است. امکان تشخیص BGCs کدکننده هر فرآورده‌ طبیعی وجود دارد اما نمی‌توان ساختار دقیق آن یا نوع فعالیت آن‌ها را شناسایی کرد‌. در قارچ‌ها سطوح چندگانه‌ای برای تنظیم BGCs وجود دارد، به همین سبب تعداد فرآورده‌های طبیعی که در گونه‌های مستقل تولید می‌شود از آنچه انتظار می‌رود بسیار کمتر است.

دستکاری در رونویسی عمومی

در ژنوم، بعضی از مجموعه‌های بیوسنتزی خاموش هستند که عملکرد آنزیم هیستون دکاتالاز را مهار می‌کنند و در نهایت موجب رونویسی از آن BGCs می‌شوند. Calcarisporium arbuscular معمولاً مهارکننده‌ ATPase اورورتین بی و دی (aurovertin B and D) را تولید می‌کند. حذف هیستون دکاتالاز hdaA، بیان را در ۴۲ عدد از ۶۸ عدد BGCs افزایش می‌دهد. در نتیجه دو سیکل یک پپتید و دو مروترپنوئید (meroterpenoids) جدید تولید می‌شود؛ اما این ترکیبات به لحاظ فعالیت زیستی همچنان ناشناخته‌اند‌.

نمونه‌های مشابه ژن mcrA در قارچ‌های زیادی شناسایی شده‌اند. حذف ژن همولوگ در Aspergillus terreus و Penicillium canescens ویژگی فرآورده‌ طبیعی را تغییر می‌دهد اگرچه که این تغیرات هنوز به‌طور کامل شناخته نشده‌اند.

مهندسی کردن‌ مسیر تولید

برخی از BGCs منفرد ممکن است توسط جایگزینی پروموترهای تحریک‌کننده، بیان بیش از حد فاکتورهای رونویسی و یا ساختارهایی که پروموترهای طبیعی دارند فعال شوند. در نتیجه این جایگزینی‌ها میزان فرآورده‌ طبیعی خاصی افزایش خواهد یافت. برای مثال در قارچ Penicillium oxalicum بیان بیش از حد فاکتور رونویسی pox (مشابه فاکتور رونویسی Gal4 است) موجب تولید داوکسالمید (oxaleimides) و چند سیتوتوکسیک مهار شده می‌شود. بیان بیش از حد فاکتور رونویسی fsqA در قارچ Aspergillus fumigatus موجب تولید فرآورده‌ فومیسوکوینز (fumisoquins) می‌شود. این مسیر بیوسنتزی مشابه مسیر تولید ایزوکوئینولین ( isoquinolines- در تولید کودئین، مورفین و بربرین کاربرد دارد) است که از گیاهان استخراج می‌شود. تحقیقات بیشتر، همکاری آنزیم‌ها در مسیرهای بیوسنتزی را نشان می‌دهد که شرایط را برای انجام مهندسی در جهت تولید انواع فرآورده‌های طبیعی هموارتر می‌کند.

غیرفعال‌سازی ژن هدف می‌تواند به یک BGC‌ که فرآورده‌ خاصی را تولید می‌کند مرتبط شود. به‌علاوه این عمل می‌تواند منجر به توقف یک مسیر بیوسنتزی در یک نقطه‌ خاص شود. معمولاً اختلال در ژن هدف در قارچ‌ها به‌علت حضور بالای نواحی انتهایی غیر مشابه به سختی انجام می‌شود. اما اخیراً چندین روش جدید ارائه شده است که می‌توانند تا حدی این کار را راحت‌تر کنند. در یکی از این روش‌ها از نشان‌گر Cre/loxP برای بازیابی سیستم استفاده می‌شود. در کنار این عمل، بیان ژنی غیر‌مشابه در Ustilaginoidea virens انجام می‌شود. اولین بار تولید اوستیلوکسین بی (ustiloxin B) توسط مجموعه‌ی ژنی RiPP توضیح داده شد. سپس شیوه‌ دستکاری ژنی برای روشن شدن نحوه‌ عملکرد تعداد زیادی از مسیرهای بیوسنتزی دیگر استفاده شد. برای مثال به فسفاتاز ۲ (مهار کننده‌ روبراتوکسین ای -rubratoxin A-است) و میکوتوکسین سرکوسپورین (cercosporin) می‌توان اشاره کرد.

برای انجام مهندسی مسیرهای بیوسنتزی توسط غیرفعال‌سازی ژن‌ها، ویرایش ژنوم با استفاده از CRISPR–Cas9 انجام شده است. در قارچ ناشناخته‌ Talaromyces atroroseus که فرآورده‌ ZG-1494a را تولید می‌کند از همین روش برای شناسایی BGC کدکننده‌ آن استفاده شد.

توسعه‌ شیوه‌ بیان غیرمشابه موجب تسریع روند مطالعه، شناسایی و مهندسی فرآورده‌های قارچی می‌شود. با وجودی که انتخاب میزبان مناسب به سبب عواملی همچون روش‌های انتقال، انتخاب نشان‌گر و فناوری‌های بیان چندگانه با مشکلاتی همراه است اما در حال حاضر بیان بسیاری از فرآورده‌های طبیعی قارچ‌ها در میزبان‌های مختلف انجام می‌شود. به‌علاوه خود قارچ‌ها نیز می‌توانند تحت مهندسی قرار بگیرند و به‌عنوان ابزاری برای بیان‌های غیرمشابه و تولید داروهای ضروری که در حال حاضر منبع گیاهی دارند استفاده شوند.

یکی از مزیت‌های مهم روش بیان غیرمشابه، امکان راستی‌آزمایی آن توسط آنتی‌بیوتیک پلیوروموتیلین (pleuromutilin) است. این ترکیب توسط بازدیومیستی تولید می‌شود که امکان دست‌ورزی ژنتیکی آن وجود ندارد. بیان BGC این ترکیب در A.oryzae موجب افزایش ۲۰۰ درصدی آن می‌شود.

فرآورده‌های طبیعی با حفظ ساختار طبیعی خود می‌توانند به شکل نیمه‌سنتزی، تغییراتی بیشتری را در جهت بهینه شدن فعالیت زیستی‌‌شان متحمل شوند. برای مثال تعدادی از مشتقات پلیوروموتیلین می‌توانند برای فعالیت به‌عنوان آنتی‌بیوتیک سیستمیک تحت تغییر قرار بگیرند.

سیستم‌های مختلفی برای کلون سریع و انجام بیان غیرمشابه BGC قارچ‌ها به‌منظور شناسایی فرآورده‌های طبیعی جدید توسعه یافته است. از جمله‌ این سیستم‌ها می‌توان به بیان غیرمشابه و کروموزوم مصنوعی قارچی و نمره‌  متابولیسم (FAC-MS) اشاره کرد. ۱۰ عدد از ۴۱ عدد BGC بیان شده در سیستم بیانی غیرمشابه، فرآورده‌های جدیدی را تولید کردند. و در سیستم FAC-MS از ۵۶ مجموعه‌ بیان شده ۱۴ عدد از آن‌ها محصول جدیدی را ارائه دادند. بیان بالای BGCs باعث می‌شود تا مقدار فرآورده‌ تولیدی در شرایط آزمایشگاهی بیش از یک گرم بر لیتر باشد. سیستم بیانی غیرمشابه از پیش‌برنده های طبیعی استفاده می‌کند که عملکرد آن‌ها منتاظر با مسیر فاکتورهای رونویسی ساخته شده است.

مسیرهای تولید فرآوده‌های طبیعی می‌توانند تغییر داده شوند. این کار از طریق تأمین ماده‌ اولیه مورد نیاز آنزیم‌های بیوسنتزی جدا شده با مواد غیرطبیعی یا اعمال تغییرات شیمیایی بر روی اجزای فرآورده‌‌های طبیعی که در محیط زنده تولید شده‌اند انجام می‌شود. برای مثال تولید سه مشابه غیر طبیعی کلادوسپورین (cladosporin) ضد مالاریا و ایجاد کتابخانه‌ای از مشابهات ناپتوپیرون (napthopyrone) به همین روش‌ها انجام گرفته است.

بیوسنتز ترکیبی

بیوسنتز ترکیبی روشی است که برای تولید BGCs جدید از طریق معرفی ژن‌های متعلق به مسیرهای بیوسنتزی دیگر به مسیر بیوسنتزی مورد نظر انجام می‌شود. اگر آنزیم‌های کد شده بتوانند با هم همکاری کنند فرآورده‌ طبیعی تولید می‌شود که یا نوع جدیدی است و یا در طبیعت گونه‌ جدیدی به حساب می‌آید، که در این صورت به آن غیرطبیعی می‌گویند. برای مثال آنزیم‌های مسیر اندول دی‌ترپن با اندول دی‌ترپن سیکلاز یک قارچ دیگر ترکیب شدند که البته در پایان محصول جدیدی حاصل نشد‌. اما ژن‌های گلیکوزیل‌ ترانسفراز- متیل‌ترانسفراز از Beauvaria bassiana با چند نوع پلی‌کتید قارچی بیان مشترک داشتند که در نتتیجه ۲۰ پلی‌کتید گلیکوزیلی شده که حلالیت و سیتوتوکسیته بالاتری داشتند ایجاد شدند. بیوسنتز ترکیبی در قارچ‌ها با هیچ‌گونه محدودیتی از طرف مجموعه‌ ژن‌های شرکت‌کننده مواجه نیست. روش بیوسنتز ترکیبی حوزه‌ گسترده‌ای دارد و حتی برای بررسی بین قلمروهای متفاوت حیات (مثل آنزیم‌های بیوسنتزی قارچی، باکتریایی و گیاهی) قابل استفاده است.

زمانی‌ که هدف، بیان فرآورده‌های طبیعی در یک میزبان، تولید آن‌ها در مقادیر بالا باشد انجام مهندسی مکان تولید نیز اهمیت پیدا می‌کند. مثلاً در مسیر تولید پنی‌سیلین، بیان بیش از حد AcvA تری‌پپتید سنتاز در کنار آنزیم‌های پراکسی‌زوم موجب تولید پنج برابری می‌شود. به‌علاوه تولید فرآورده‌های طبیعی قارچی برای بافت ‌های مختلف اختصاصی هستند.

مهندسی آنزیم

تا به امروز بیشتر تغییراتی که بر روی پلی‌کیتید سنتاز (polyketide synthase) قارچ‌ها و پلی‌کیتید سنتاز- پپتید سنتاز غیر ریبوزومی انجام شده است برای انجام برنامه نویسی‌های لازم بوده است‌. اما ویژگی‌های مدولار و تکرار این آنزیم‌ها برای مطالعه به شیوه‌‌ای جدید، شروع مناسبی است. جابجایی بین بنزندیول لاکتون (benzenediol lactone) و آزافیلون پلی‌کیتید سنتاز (azaphilone PKS) موجب تولید ۱۳ فرآورده‌ جدید شد.

آنزیم‌های پلی‌کیتید سنتاز -مشابه پپتید سنتازها- پپتید سنتازهای تکراری و ترپن‌سنتازها می‌توانند از طریق بازسازی آنزیم‌های کایمریک دوباره برنامه‌ریزی شوند. بازسازی‌ها به سبب جابجایی واحدها بین پروتئین‌های چندکاربرده انجام می‌شود. حتی امکان اضافه شدن واحد اضافی برای شکل‌گیری آنزیم‌های عمل‌گر جدید از سیستم‌های دیگر وجود دارد.

کاربردهای کاتالیست زیستی

مطالعه‌ مسیرهای بیوسنزی قارچ‌ها نقش مهمی در کشف و شناسایی ویژگی‌های آنزیم‌های جدید دارد. زیرا اکثر فرآورده‌های طبیعی که به لحاظ زیستی فعال هستند ابتدا ساختمانی ساده دارند و سپس توسط آنزیم‌های انتهایی به ساختارهای پیچیده‌تری تبدیل می‌شوند و کارایی پیدا می‌کنند. اضافه کردن یا تغییر گروه‌های فعال به یک مجموعه‌ پیچیده چالش بزرگی به حساب می‌آید. به‌علاوه ممکن است دمای بالا، مواد سمی و زنجیره واکنش‌های طولانی مورد نیاز باشد. بنابراین می‌توان از قدرت بیوسنتزی این آنزیم‌ها برای انجام واکنش‌های سخت استفاده کرد؛ به‌خصوص اگر این آنزیم حوزه‌ عمل‌کنندگی گسترده‌ای نیز داشته باشند.اکثر این آنزیم‌هایی که در جدول زیر آمده است، از نوع انتهایی هستند و بر روی محدوده وسیعی از سوبستراهای آزاد اثر می‌گذارند. داروسازان به فرآورده‌هایی همچون سیلیکوسیبین (psilocybin) که در شرایط آزمایشگاهی و با آنزیم‌ها سنتز می‌شوند علاقه دارند.

آنزیم هایی که توسط آن ها امکان تولید فرآورده های طبیعی جدید در آزمایشگاه وجود دارد

نتیجه‌گیری نهایی

پیشرفت‌ها در زمینه‌ شناسایی و مهندسی BGCs قارچ‌ها، امکان توسعه‌ تولید بسیاری از فرآورده‌های طبیعی جدید را فراهم کرده است. هر کدام از شیوه‌هایی که انجام می‌شود نقاط ضعف یا قوتی دارد و بهترین روش به موضوع تحقیق بستگی دارد. برای بررسی امکان دست‌یابی به مقادیر زیادی از فرآورده‌های طبیعی در یک گونه‌ منفرد قارچی، بهترین شیوه‌ها دستکاری رونویسی عمومی یا بیان بیش‌ از حد فاکتورهای رونویسی است. اما برای تولید موارد مشابه از یک مولکول زیستی، شیوه‌های مهندسی مسیرهای طبیعی از طریق دستکاری یا بیان بیش از حد، بیوسنتزهای ترکیبی، تغییرات شیمیایی حدواسط‌های واکنش‌گر و اصلاح اجزای تشکیل دهنده همگی گزینه‌های مناسبی هستند.

حتی در موجوداتی که به‌طور ژنتیکی مقاوم هستند، روش بیان غیرمشابه امکان مهندسی کردن مناسبی وجود دارد و همچنین روش‌های بیانی مصنوعی با کارایی بالایی نیز در همین بخش توسعه داده شده‌اند. پیشرفت در زیست‌شناسی سنتزی، سنتز ژن با هزینه‌ کم و قابلیت دسترسی به انواع شاسی‌های میکروبی، موجب محو شدن محدودیت‌های طراحی مسیرهای جدید شده است. پیشتر مسیرهای مصنوعی از ترکیب قارچ‌ها، باکتری‌ها و گیاهان با موفقیت برای تولید فرآورده‌های طبیعی که تا پیش از این در طبیعت نبوده‌اند ساخته شده است. با وجود پیشرفت‌های زیادی که در این پژوهش در زمینه‌ فرآورده‌های طبیعی قارچی اتفاق افتاده است اما همچنان چالش‌های زیادی بدون راه‌حل باقی مانده‌اند.